副猪嗜血杆菌的分离与鉴定(论文资料)

1、副猪嗜血杆菌的分离与鉴定李晓华*杨小燕郑新添戴爱玲李改娜（福建龙岩学院生命科学学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室福建省人畜寄生与病毒性疫病防控工程技术研究屮心福建龙岩 364000）摘要：从福建省龙岩市1例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的恵病猪的关节液中分离到1株革兰 氏染色阴性可疑菌株，经卫星现象、牛化鉴定等实验家诊断，进一步以副猪嗜血杆菌的16srrna基因设计特 异性引物进行pcr鉴定，确定该分离菌为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果表明，分离株对环内沙星、氨节西林、 阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考、磺胺类等药物敏感；对阿莫西林、诺氟沙星有抵抗力。关键词：副嗜血杆菌；分离鉴

2、定；药敏试验isolation and identiflcation of haemophilus parasuisxiaohua-li xiaoyan-yang xintian-zhengailing daigaina-li1. college of life sciences, longyan university, longyan, fujian province 364000, pr china2. key laboratory of preventive veterinary medicine and biotechnology, longyan university, longya

3、n, fujian province 364000, pr china3. engineering research center for the prevention and control of zoonosis, fujian province 364000, pr chinaabstract： a covey of swine whose clinical symptoms looked like haemophilus parasuis disease were checked by lab technologies. research as bacteria observation

4、, cultural characteristics and biochemical properties of haemophilus parasuis were done. according to the sequence of bacterium 16s rrna, special primers were designed for pcr amplification. the results showed that the strain was tentatively identified as haemophilus parasuis. the drug sensitive tes

5、ts showed： the strain was sensitive to环丙沙星、氨节西林、阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考、磺胺 类等药物敏感；对阿莫西林、诺氟沙星.key words： haemophilus parasuis； isolation and identification; drug sensitive test李晓华(1968、8-)，女,福建长汀人，鬲级实验师，主要从事实验爲管理及动物疫病防控研究。*通讯作者基金项h：祸建省科技厅创新平台建设项h (fj200812)福建省科技计划项目(2008n2005)猪副嗜血杆菌病（haemophilus parasuis, hps

6、）又称“革拉瑟氏病” （gllisser's disease），是由副 猪嗜血杆菌haemophilusparasuis'）引起的一种以多发性浆膜炎和关节炎为特征的疾病叫该菌寄 生在健康猪鼻腔等上呼吸道内，主要通过空气直接接触传播，其他传播途径如消化道等亦可传播 。主耍影响24周龄的猪，感染高峰为46周龄的猪，发病率在10%15%，严重时病死率可 达50%。随着规模化养殖和养殖密度的增加，近年来，该病的发病率和死亡率均呈上升趋势，成 为危害规模化养猪场最严重的细菌性疾病么一，给养猪业造成巨大的经济损失。2008年10月，福 建龙岩某规模化猪场58周龄的保育猪发病严重,临床症状主

7、耍表现为精神沉郁、食欲减少，体温 升高40-4pc,流鼻涕，腹式呼吸，被毛粗乱，消瘦、关节肿大，病猪不愿站立，跛行，病程达4个多 月，发病率40%。剖检病变主要表现为体内有水肿、充血、血液不凝，呈暗红色，全身脏器多数有出 血斑点，膀胱粘膜和肾皮质点状出血，喉、会咽斑状出血，胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物; 心包冇大量纤维素性渗出物，似菜花状；肺脏呈纤维索性胸膜肺炎，腹腔内冇人量透明黄褐色渗出 液；关节腔内充满黄色浑浊液。怀疑猪副嗜血杆菌感染而致，随机釆集病料进行病原分离鉴定及 药敏试验。1材料与方法1.1材料1.1.1病料采h福建省龙岩市某猪场疑似hps发病仔猪的肺脏、心血、关节积液、心

8、包液、气管。1. 1.2培养基普通琼脂培养基、鲜血琼脂培养基、巧克力琼脂培养棊由实验室配制、锁蛋白丿冻大豆琼脂（tsa） 培养基购于青岛海聘公司；0.005%nad巧克力琼脂培养基、ss培养基、麦康凯培养基购于北京陆 桥技术有限责任公司；烟酰胺腺瞟吟二核甘酸（nad）购于成都贝斯特试剂有限公司1. 1.3生化微量鉴定管h2s.蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、山梨醇、lt露醇、尿素酶、赖氨酸、鸟氨酸、苯内氨酸、 葡萄糖、d-核糖、葡萄糖酸、柠檬酸盐均购自杭州天和微生物试剂冇限公司。1.1.4药敏试纸：强力霉索、阿莫西林、磺胺-6-甲氧口密噪、坏丙沙星、氨茱西林、头殖囉咲钠、 阿米卡星、恩诺沙星、诺氟

9、沙星、卡那霉素、庆大霉素、氟苯尼考、复方治菌磺、林可大观、殒 胺间甲氧喘唏、泰妙菌索、泰乐菌素等药敏纸片由实验室自制。1. 1.5pcr反应试剂:如taqdna聚合酶（5iu/pl）、蛋白酶k、dntps,均由宝生物（大连）有限公 司提供，-20 °c保存。1.1.6引物设计与合成参照simone oliveira等的报道合成引物：上游引物 p1 :5 '-gtgatgaggaagggtggtgt-3z，下游引物 p2： 5 -ggcttcgtcaccctctgt-3,预扩增 片段大小为821bpo引物由上海生工生物工程有限公司合成。1.2方法1.2. 1细菌的分离培养 无菌

10、取送检的疑似患病猪的肺脏、心血、心包液、气管和关节积液， 划线接种于巧克力培养基和5%新牛牛血清tsa培养基八置于37°c恒温培养箱中，烛缸培养24-48h, 观察结果。1.2.2细菌形态及生化特性检查1.2.2.1细菌形态学检查 挑収tsa平板上生长的疑似菌落涂片，革兰氏染色镜检，观察细菌的 形态特征。1. 2.2.2细菌培养特性 挑取tsa平板上生长的单菌落，分别接种于含0.005%nad的兔鲜血琼 脂培养棊平板、5%新生牛血清tsa培养棊平板、鲜血琼脂培养基平板、巧克力琼脂培养基平板、 麦康凯培养基和普通培养基平板屮，置于379ctu温培养箱中，烛缸培养24-48h0观察细菌的

11、生长情况。1.2.3卫星试验 在两个不含v因子的兔鲜血琼脂平板上接种可疑菌株，一个平行划线接种两行 金黄色超萄球菌，另一个作对照。在培养箱中37°c烛缸培养48h,观察结果。1.2.4生化鉴定 将分离所得对疑菌株的纯培养物分别接种于h2s、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳 糖、山梨醇、甘露醇、尿素酶、赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖、d核糖、匍萄糖酸、柠檬 酸盐微量牛化鉴定管小，每支住化管中同时加入1ul牛血清和1hlnad的（v因子）置于37°c恒 温培养箱，烛缸培养24-48h,观察结果。接触酶试验：挑取单菌落在一洁净的玻片上，滴加30%的过氧化氢，30s内观察反应结果。1.2

12、.5 pcr 检测1.2.5. 1细菌d7a的提取挑取单菌落进行亚克隆培养，用灭菌的双蒸水小心刮洗菌苔，置于1.5ml离心管中。12000rpm 离心30s,弃一上清,保留细胞沉淀;加入567ute悬浮沉淀,用等体积酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1）抽提,，使两相完全混合，冰浴10分钟。12000rpm离心10分钟，吸取上清液，等体积氯仿：异戊 醇（24： 1）再抽提次，至溶液屮有絮状的dna沉淀出现；将dna沉淀转移到lml70%乙醇屮洗涤， 65"c干燥箱中干燥2分钟。用50-looplte缓冲液（含20yg/mlrnase）溶解dna沉淀，即为试验所需模 板，4c保存备

13、用。1. 2.5.2 pcr鉴定以上述方法提取得到的菌株dna为模板，将pl、p2等比例混合，pcr反应体系为50|il:10xtaq buffer5|il, 10nmol/ldntp2nlztemplate2|il,5u/|iltaqdna聚合酶h2o36|il,上、卜游引物（浓度 均为 10 pmol / l）各邛 l,反应条件为94°c 5min； 94°c 30s, 58°c 30s, 72°c lmin,30个循环;72°c 7mino pcr产物用1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。1.2.6药敏试验无菌棉签蘸取分离菌的菌悬液,涂布接种于

14、含nad及新牛犊牛血清的tsa平板上，然后把做好 的药物纸片用无菌蹑子分别平贴于培养基表而，于37°cco2培养箱屮培养24h,测量抑菌坏直径并判 定结果。判断标准为：抑菌圈直径小于15 mm的为不敏感,1520 mm的为中度敏感,20 mm以 上的为高度敏感。2结果2.1细菌的分离培养収关节液划线接种的巧克力培养基上出现无色、透明的小菌落，接种于普通培养基不生长。接 种于tsa平板，可见冇针尖大小、圆形、光滑湿润、无色透明、边缘整齐的小菌落生长。2.2细菌的形态学检查取分离所得可疑菌落涂片，革兰氏染色后在光学显微镜下见到革兰氏阴性的短杆状或球杆状 小杆菌，以纤细杆状居多。2.3培养

15、特性该菌在普通琼脂平板、麦康凯培养基中均未见生长，在鲜血琼脂平板、巧克力平板上生长不 好，在tsa平板、nad鳞血琼脂平板上生长良好。表1细菌培养特性table 1 .the cultural characteristics of the isolatied strains培养基生长情况菌落形态普通培养基 麦康凯培养基ss培养基鲜血琼脂培养基巧克力琼脂培养基+0. 005%nad的鲜血琼脂培养基卄+含5%新生牛血清和0. 005%nad tsa培养基+极少数无色透明、边缘光滑、湿润的针尖 状大小菌落，传代后几乎不生长无色透明、边缘光滑、湿润、针尖状大小 的菌落，传代后几乎不生长无色透明、边缘光

16、滑、湿润的菌落，菌落 呈针尖状大小，边缘整齐无色透明、边缘光滑、湿润的菌落，菌落 呈针尖状大小，边缘整齐，人最的菌落连 成一片注：“+ ”生长良好；“+”生长一般；“+”生长但生长较差；“ + ”生长但极难生长；“-”不长。2. 4卫星现象试验观察结果可见，越接近葡萄球菌所形成的菌株，菌落越人、越多，离葡萄球菌愈远，菌 落越小、越少，甚至不生长，呈现出明显的“卫星现彖”。2.5生化鉴定结果分离株生化鉴定结果见表2。表2：分离菌生化鉴定结果table 2.the biochemistries identification of isolatied strains项冃h,s蔗糖saccharose

17、麦芽糖乳糖半乳糖山梨醇甘露醇尿素酶接触酶itemmaitobioselactosegalactosesorbitolummanciolurasecatalase结果_ +result项目赖氨酸 鸟氨酸苯丙氨酸 葡萄糖d-核糖葡萄糖酸盐柠檬酸盐item lysine orni thine i 厂 phenylalanine dextrosribosegluconatecitratewwresult注：“- ”阴性；“+ ”阳性。note:" + *'positive /' -" negative.2.6 pcr反应结果82 lbp以提取的总dna产物作为模板，

18、用pcr方法扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统中 观察，发现被检菌株冇约821bp的特异性条带，其大小与预期的扩增片段大小相符。如图2：10025050075010002000m 12图2： pcr检测结果m： dna标准dl 2000； 1:分离株pcr产物；2：阴性对照figure 2.results of pcr identificationm: dna marker dl 2000; 1: results of pcr amplification ;2.7分离菌药敏试验结果显示，该菌对环丙沙星、卡那霉素、强力霉素、头砲曝咲钠、氨茉西林、 庆大霉素高敏，对泰乐菌素、磺胺-6-

19、甲氧i密呢中敏，対林可大观、泰妙菌素、诺氟沙星磺胺间 甲氧喘喘低頌，见表3。表3:分离菌药敏试验结果药物抑菌圈直径/mmdrugsdiameter环丙沙星 ciprolfloxacin32e那得素 kanamycin30强力霉素doxycycline26头抱 1 壅咲内 ceftiofur sodium24氨节西 ampicillinsuppositories23庆大霉素gentamicin22阿米卡星amikacin20泰乐菌素tylosin18磺胺-6甲氧昭定 sulfamonmethoxine17林可大观 spectinomycin hydrochloride14泰妙菌素tiamulin

20、12诺緘沙星norfloxacin10碱胺间甲氧嘯定sulfamonomethoxine6注：抑菌总径dn20nmi为高度敏感；15nmiwd20nun为中度高敏；d<15mn）为不敏感。3讨论与小结3.1根据分离菌的菌落形态特征、镜检结果、生化特性及卫星现象结果，初步鉴定为副猪嗜血杆 菌，以iips的16srrna'|'li<j基因序列设计合成引物，进行pcr扩増，成功扩增出长约821bp的16srna 基因片段，说明分离菌株为hps。该菌在普通琼脂平板、麦康凯培养基中均耒见生长，在鲜血琼脂 平板、巧克力平板上牛长不好，在tsa平板、nad鲜血琼脂平板上牛长良好。

21、说明5%新生牛血清tsa 培养基是hps的理想培养基。3.2该菌的药敏结果显示，对环丙沙星、卡那霉素、强力霉素、头砲噬咲钠、氨茉西林、庆人霉 素高敏，对泰乐菌素、碱胺6训氧喘噪中敏，对林可大观、泰妙菌素、诺氟沙星横胺间卬氧唏 喘低嫩，与高鹏程、吕素芳等的研究结果基本相同。3. 3本研究根据hps的16 s rrna序列设计引物进行pcr扩增，通过热裂解法和ctaba裂解法对 pcr扩增条件进行优化，成功扩增出了 821bp片段，所建立的pcr检测方法不仅可从分离培养物 屮对hps进行鉴定，而且可以直接对病料进行pcr检测，在临床诊断中具有实用性。3.4近年來，副猪嗜血杆菌病己成为影响世界养猪业

22、的典型细菌性疾病，危害口益严重，已经在 全球范用影响着养猪业的发展，成为断奶前后仔猪和保冇猪头号杀手，死亡率高达50% 9%,给 养猪业带来的危害与经济损失已不容忽视。国内在北京、黑龙江、辽宁、河南、湖南、宁夏、湖 北、江苏、上海、安徽、广西、浙江、江西、山东、福建等省市都均有发生,损失惨重化 本研 究借助传统方法和特界性高的pcr方法鉴定副猪嗜血杆菌病，为深入研究猪hps感染的快速诊断及 有效防治提供了实验依据。3. 5由于猪副嗜血杆菌对抗生素的耐药性问题，冃前大多采用疫苗对猪副嗜血杆菌病进行防制, 然而，猪副嗜血杆菌的血清型较多，且不同血清型之间无交义保护力，若不知当地流行的血清型 而随便应用商品化疫苗，猪副嗜血杆蔚病就不能得到有效控制。目前己知的副猪嗜血杆菌至少可 分为15种血清型，还冇20%以上的分离株无法定型9-10而且hps具冇明显的地方性特征，不同 地区流行的血清型有可