KRAS和EGFR检测与临床应用

1、.KRAS和EGFR检测与临床应用.汇报内容?KRAS和EGFR的简介及临床意义?ARMS-PCR的基本原理和技术特点?等位特异性引物设计?KRAS试剂盒开发简介.KRAS和EGFR的简介及临床意义.KRAS背景背景?KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信号通路的调控；?EGFR在通路中位于KRAS上游，配体与之结合后可以激发其酪氨酸激酶活性，导致KRAS的活化和通路中信号传导；?KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因：胰腺癌（65%-90%）、结直肠癌（40%）、肺癌（20%）、卵

2、巢癌（15%）。.KRAS基因突变影响结直肠癌药物疗效基因突变影响结直肠癌药物疗效?KRAS基因野生型的转移性结直肠癌患者能从EGF抗体（西妥昔单抗、帕尼单抗）治疗中获益，而基因突变的患者治疗效果很差；KRAS突变型患者对西妥昔单抗无应答，其总体生存期明显低于KRAS野生型患者Karapetis CS, 2008, N Eng J Med.结直肠癌患者检测KRAS突变相关指南?欧洲药品评估局（ EMEA，2008）指出： KRAS野生型的进展期结直肠癌患者可能从帕尼单抗中受益，而突变型患者受益较少。?美国临床肿瘤学会（ ASCO，2009）推荐：转移性结直肠癌患者应检测 KRAS突变，如有KR

3、AS12 、13位突变，则不应进行 EGFR单克隆抗体治疗；?美国FDA指南推荐：在使用靶向药物西妥昔单抗和帕尼单抗治疗转移性结肠直肠癌前必须检测KRAS基因的基因型； 2012年7月6日批准第一个用于结直肠癌的基因检测（Qiagen ），以判断西妥昔单抗是否有效；?美国国立综合癌症网络（ NCCN，2014）指南说： 转移性结直肠癌患者均应进行 RAS突变检测（ KRAS和NRAS），至少应检测 KRAS第二外显子的突变情况 。KRAS或NRAS突变型的病人不应采取西妥昔单抗或帕尼单抗治疗。?中国卫生部于 2010年10月14日发表了结直肠癌诊疗规范（ 2010版） 。明确指出在患者确定为复

4、发或转移性结直肠癌接受西妥昔单抗、帕尼单抗时，必须检测肿瘤组织的K-ras 基因状态。在晚期 /转移性结直肠癌化疗中，在治疗前检测肿瘤K-ras 基因状态，EGFR不推荐作为常规检查项目。.KRAS基因突变影响非小细胞肺癌药基因突变影响非小细胞肺癌药物疗效?KRAS基因野生型的非小细胞肺癌患者能从小分子酪氨酸激酶抑制剂（ TKI，如吉非替尼、厄洛替尼）治疗中获益，而基因突变的患者易发生抵抗；KRAS突变型患者使用厄洛替尼联合化疗后，其无症状生存期和总生存期明显低于野生型患者（图中红线所示）Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA

5、, 2005, J Clin Oncol .非小细胞肺癌患者检测非小细胞肺癌患者检测KRAS突变相突变相关指南关指南?美国国立综合癌症网络（NCCN，2009）指出，KRAS突变与非小细胞肺癌患者TKI抵抗有关，KRAS基因测序有助于确定哪些病人适合TKI治疗。当KRAS基因发生了突变，则不建议病人使用厄洛替尼进行分子靶向治疗。.KRAS主要突变位点主要突变位点?在结直肠癌中，KRAS突变主要发生于codon12 (80%) 、codon13 (15-20%)、codon61 和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1

6、)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S192240-2257del1812370E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P

7、192238-2248 GC(complex)12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)12419L747-E749del192239-2247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369

8、L747-T751P192239-2251 C(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769-D770insASV202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA6213.EGFR突变与EGFR-TKI药物疗效关系所在外显子突变类型与EGFR-TKI疗效关系18G719A(S/C)3种点突变药敏突变1919种缺失突变药

9、敏突变20点突变S768I药敏突变20点突变T790M耐药突变*203种插入突变耐药突变*21点突变L858R药敏突变21点突变L861Q药敏突变.ADx EGFR试剂盒突变结果检测组别突变类型所占比例对吉非替尼敏感性证据1Exon 19 deletions; L858R 90%充分2T790M/deletion; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7%有限3T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations 3%无.ARMS-PCR的基本原理和技术特点.ARMS-PCR原理原理?ARMS是Amplification

10、 Refractory Mutation System (扩增阻碍突变系统)的缩写。?根据 PCR过程中要求引物和模板间的严格互补配对来实现对突变位点的检测, 当引物 3 末端出现错配时, 产物将不能延伸。?因此设计两条上游（或下游）引物，使其3末端分别与突变位点碱基匹配和错配，共用下游（或上游）引物，分别扩增野生型和突变型目的片断。.ARMS-PCR原理原理Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorp

11、hic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forward primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). You F. M. 2008, BMC Bioinformatics.PCR产物检测产物检测-Real time PCR?每个PCR循环检测荧光信

12、号，不同PCR产物，不同荧光信号?相比凝胶电泳：更快，可定量，无PCR产物污染?信号产生方法：Scorpion (Qiagen) ，双环探针(厦门艾德)，Taqman，Molecular beacons ，Sybr green ，Yo-proFigure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer.应用于Real time-PCR 的ARMS-PCRGCATGAAGG alleleA allele55553333AS primerAS

13、primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe.ARMS技术特点优点：?灵敏度高（0.1-1%）?操作简便?周期短?不产生PCR产物污染?适用样本类型多（如FFPE）?精确突变类型缺点：?方法建立需时较长?仅能检测已知突变.测序法与ARMS法相比较Sanger测序法焦磷酸测序ARMS敏感度10-20%5-10%1%FFPE标本成功率低较高高商用试剂盒无有有流程与速度1-2天2-3天AGTGly13SerGGCAGCGly12ArgGGTCGTGly13ArgGGCCGCGly1

14、2CysGGTTGTGly13CysGGCTGCGly12AspGGTGATGly13AspGGCGACGly12AlaGGTGCTGly13AlaGGCGCCGly12ValGGTGTTGly13ValGGCGTC.三引物设计原理三引物设计原理You F. M. 2008, BMC Bioinformatics.三引物设计ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT GGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAA

15、TTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG?野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51?突变型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49?下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC- 325nt，54.三引物设计下游引物设计ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGAT

16、TCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG? 选择序列选择序列： 5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG- 3?互补链：3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC- 5?下游引物：5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC - 3.3端增加错配端增加错配?如果3端是弱错配（C/A或G/T）则需要引入强的错配（A/G或C/T）才可阻断3端的扩增；?如果3端是强错配（A/G或C/T）则需要引入弱的错配（C/A或G/T）或不需引入错配即可阻断3端的扩增；?

17、当3端是中度错配（A/A，C/C，G/G 或T/T）则需要引入中度的错配。?野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 ?突变型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3?下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC- 3.四引物设计四引物设计.四引物设计?ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT GGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGAT

18、GGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG?内引物（F）?5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 ?内引物（R）?5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3?外引物（F）?5-ATGACTGAATATAAACT- 3?外引物（R）?5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-3.KRAS试剂盒开发简介.KRAS突变探针和引物设计突变探针和引物设计?KRAS序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTT GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGA ATCATTTTGTG

19、GACGAATATGATCCAACAATAGAGG ATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 12GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GC G GT-3 12GGT GTT3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT4. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT5. 5- AA CT

20、T GTG GTA GTT GGA GC G T-3 12GGT TGT6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GC C C-3 12GGT CGT7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC8. 参照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT -39. 下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探针：探针：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT -BHQ1-3锁核酸阻滞探针(野生型)：5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P