黄曲霉毒素B1检测方法的分析

1、黄曲霉毒素b1 检测方法的分析叶雪珠王小骊赵燕申董秀金( 浙江省农科院农产品质量标准研究所 ,杭州 , 310021)摘要黄曲霉毒素 b1 是一种致癌物质 , 许多国家 已将其限量 标准提高 , 黄曲霉 毒素 b1 检测方法的检出限已因其毒性而提高 ,并已成为国际贸易中新的技术壁垒。文中介绍了黄曲霉毒素 b1 的几种常见检测方法,并对其特点及检出限进行了概括性的分析 。关键词黄曲霉毒素b1, 检测方法 ,第一作者 : 硕士 , 助理研究员。收稿时间 : 2003-07-11黄曲霉毒素 (aft) 是公认的天然强致癌物质之一 , 其中以黄曲霉毒素b1( aftb1) 毒性最大 , 它们常存在于各

2、种动物饲料和人类食品中。用污染的饲料饲养畜禽, 会导致肉、乳及其制品的污染, 人类食用被污染的食品会导致急性中毒,引起肝脏坏死出血, 慢性中毒可引起肝癌。同时用被污染的饲料饲养畜禽会使畜禽生产率降低, 增重减慢 , 造成重大经济损失 1,2。迄今为止, 急性 aft中毒病例在世界上许多国家, 尤其在发展中国家报道较多。因此各国对食品及饲料中 aftb1的限量进行了规定 3, 欧盟等国在2002 年对粮食、花生及其产品中的aft b1 的限量进行了修订 , 再次提高上述农产品中的aftb1的限 量 标 准 , 如 供 人 类 直 接 食 用 的 花 生aftb1 限量为2 g/ kg, 作为食品

3、原料进口的花生 aftb1 限量为8 g/ kg。我国也先后于 1982、 1992 和 1998 年制定并实施了食品和饲料中aftb1 允许含量的强制性国家标准 , 但限量要求仍低于国外。目前在出口食品中aftb1 已经成为限制出口的技术壁垒, 为保障食用者的健康,应对技术壁垒 , 在全球贸易竞争中立于不败之地, 必 须 加 强 aft b1 的 监 测 工 作, 提 高aftb1 的检测技术已是势在必行。近年来,关于 aftb1 的检测 方法研究较多, 大致可分 为 薄 层 层 析 法 ( tlc )、液 相 色 谱 法(h plc) 和酶联 免疫法 (elisa) 。本文根据相关 报道

4、, 总结 分析了aft b1 的几种检测方法 , 并对其特点及检出限进行了比较。1薄层层析法 ( tlc)tlc 法是检 测 aftb1 的最 常用方法 ,也是我国测定食品及饲料中aftb1 的国家标准方法之一 4, 5, 其原理 是针对不同的样品, 用适宜的提取溶剂将aftb1 从样品中提取出来 , 经柱层析净化 , 再在薄层板上层析展开、分离 , 利 用 aftb1 的 荧光性 , 根据荧光斑点的强弱与标准比较测定其最低含量。tlc 有单向展开和双向展开法, 其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质, 提高灵敏度。tlc 法由于设备简单 , 易于普 及, 所以国内外仍在使用, 但由于该法样品

5、前处理繁琐, 且提取和净化效果不够理想, 提取液中杂质较多因而在展开时影响斑点的荧光强度,而双向展开虽避免了杂质干扰, 但增加了操作步骤和时间。王宏 亮 6对国 标 gb/ t5009 221996所规定的方法进行了部分改进, 在利用ccl4抽提前 , 加入质量分数25% 的醋酸铅溶液和质量分数4% 的 nacl 溶液 , 再用 ccl4振动抽提 , 于薄层板点样后展开时, 先用 ccl与丙酮的混合液正向展开, 然后用无水乙醚进行反向展开 , 回收率为76 9% , 最低检出限量为 5! 10- 9, 改进后的方法进一步排除了蛋90食品与发酵工业food andfermentation ind

6、ustriesvol 29no 10综述与专题评论白杂质 , 使提取与净化效果增强, 在薄层双向展开时组分分离也更完全, aft b1 形成的斑点易观察 , 操作简便 , 但无疑也增加了操作步骤。张鹏等 7利用多功能净化柱(m fc) 单向展开薄层色谱法检测花生中aft b1。以乙腈 水( 体积比1?9) 提 取样品 中 aftb1, 经mfc 净化柱浓缩后采用hsg60 薄层板 , 以丙酮 氯仿 (体积比 1?9) 展开 , 薄层扫描仪荧光检测 扫描定 量。可 同 时测 定 b1、 b2、 g1、g2,b1检测限达到5 ! 10-10g, 平均回收率大于 96%。该法提高了工作效率, 一步完

7、成净化, 排除了样液中脂类、 蛋白质、 糖类等杂质的干扰 , 具有快速、 高效等特点, 且分离效果理想 , 但提高了成本。tlc 法是检测aftb1 的经典 方法 , 仍为普通实验室的常用方法。2液相色谱法 (hplc)h plc 是 近 几 年 发 展 起 来 的 检 测aftb1 方法 , 主要是用荧光检测器检测, 在适宜的流动相条件下, 采用反相c18 柱, 使多种黄曲霉毒素同时分离。该法 快速而准确, 但需要昂贵的仪器设备, 未能广泛使用。关于 hplc 法检测 aftb1 的有关研究报道也很多。林奕 芝 8研 究 将 aftb1进 行 柱 前衍生, 采 用 三 氟 乙 酸 将aftb

8、1衍 生 成aftb2a, 应 用 h plc fld ( 美 国惠 普 检 测器) , 在激发波长365nm, 荧光波长 450nm, 流动相甲醇水为体积1? 1, 流 速 1 0ml/ min,色 谱 柱 为hypersul, ods 条 件 下, 测 定aftb1 衍生物 , 得到了 aftb1 浓度与峰面积的良好工作曲线, 相关系数r = 1 000, 精密度、 准确度好 , 灵敏度高 , 回收率达到95% 101% , 检出限为0 2ng( 2 ! 10- 10g) 。宋欢 9采用佛罗里硅土净化柱净化, 三氟乙酸柱前 衍 生 检 测 饲 料 中 aft b1, 回 收 率 为83%

9、, 相关系数r = 0 9998。文镜 10采用国产硅镁吸附柱层析分离纯化玉米中aftb1,用 h plc 法检测 , 方法简便 , 纯化效果好,最低检 出 量 0 08ng ( 8 !10- 11g) , 回 收 率为92 87% ,该法 制柱方 便, 而 且降低 了成本。李佐卿等 11则将免疫学技术和hplc 法相结合, 采 用 免 疫 亲 和 柱 对 样 品 进 行 净 化,aftb1 回 收率 达到 97 3% , 相 关系 数 r =0 9994, 最低检出限为6 25pg( 6 25 ! 10-12g), 该法将提取、 净化、 浓缩一次完成 , 大大简化了前处理过程, 提高了工作效

10、率及方法的灵敏度 , 但增加了成本。h plc 法可同时分离多种黄曲霉毒素,操作简便 , 定量精 确, 适 于大批量样品的分析, 但由于仪器昂贵, 未能广泛应用。3酶联免疫法 ( elisa)elisa 方法是利用免疫、 酶及生化技术来检测 aftb1,开辟了 aftb1 分析的新领域。elisa 是上世纪70 年代出现的新的免疫技术 , 最初由荷兰学者van weeman 和瑞典 学 者engvall 与 perlman 几 乎 同 时 提出 12, 主要用于病毒的检测, 70 年代中后期开始用于真菌毒素的检测13。其原理是抗原( 或抗体 )吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标抗体 ( 或抗原

11、) 与标本中的待测物( 抗原或抗体 ) 起特异的免疫学反应, 最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。大体分为2 类: 一 是 用双 抗 体 夹心 法 检测 样 本 中的aftb1, 如 sashidha 将 aftb1 牛 血清白蛋白涂覆于微滴定板池, 经初步培养后 , 加兔的aftb1 抗体和游离aftb1, 用磷酸4 硝基苯酯作基质 , 以碱性磷酸酶抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合; 二是用竞争法检测样本中的aft b1, 如在涂抗体的小孔中, 用已萃取的黄曲霉毒素b, 并与结合了辣根过氧化物酶的 aftb1 混合 , 室温下10min 后 ,用水洗去未结合的aftb1 共轭体 , 加

12、底物 ,在405nm 检 测。为得 到特异性更强 的 elisa法, 发展了aftb1 单克隆抗体的酶标记免疫吸附测定法, kawamura 用 间接和直接竞争 elisa法分析 aftb1, 检出限小于1ng。为了使用方便, 目前国内外已研制了酶标记91第 29 卷第 10 期叶雪珠等 :黄曲霉毒素b1 检测方法的分析综述与专题评论免疫吸附测定试剂盒及配套仪器, 方法也被列入国 家标 准( gb/ t 5009 221996 第二法) 4。关于运用酶联免疫法检测aft b1 的检测报道也较多, 目前国外已有较成熟的检测食品及饲料中aftb1 等真菌毒素的elisa试剂盒出售 , 我国自20

13、世纪 90 年代以来也有一些以 elisa 检测食品及饲料中aftb1的研 究 报道。如陈 福 生14报 道 了 酱 油中aftb1 的 elisa检测 , 方法简 便、 快 速, 回收率大于 82% ,与 t lc 法相比 ,elisa法检出值更高。刘冬儿 15报道了食品中aftb1的 elisa测定 , 线 性范 围 0 25 5 00ng/ml, 检测灵敏度达0 015g/ kg, 比薄层色谱法提高 300 400 倍 , 回收率大于89 2% ,精密度高 , 测定时间短 , 只需 4h。基于抗原抗体特异性反应建立起来的酶联免疫吸附分析法, 具有特异性强、 分析时间短的特点 , 而且其灵

14、敏度与tlc 或 hplc 法相当或更高 , 样品前处理简单, 提取后就可直接测定 , 不需要净化过程, 一次可测定大量样本。因此 , 在现场监控和基层的大规模筛选检测中 , 免疫学方法更实际, 具有更广阔的应用前景。参考文献1孟昭 赫, 张国 柱, 宋 圃菊 主 编, 真菌 毒 素 研究 进展. 北京 : 人民卫生出版社 ,19792居乃琥 . 黄曲霉毒素 . 北京 :轻 工业出版社 , 19803gb/ t5009 221996, 食 品中 黄曲 霉 毒素 b1 的测定方法4gb83811987, 饲料中黄曲霉毒素 b1 的测 定方法5王宏亮 . 粮食与饲料工业,1998, 1: 40 4

15、26张鹏, 张艺兵 ,赵卫东 . 分析测试 学报 ,1999, 18( 6):7林奕之 . 肉类研究 ,1999, 2: 46 478宋欢山西农业大学学报,2001, 3: 257 2589文境. 食品科学 ,1996, 17:68 7010李佐卿 ,谢东军 , 孙大为 等. 光谱实 验室, 2001,18(1): 28 3111蒋成淦 ,陶义 川. 酶 免疫测 定法 . 北京 : 人 民出版社 ,198412chu f s u sno iappl and environ microbiol,1977(5) : 1125 112813陈福生 ,李根久 . 中国调味品 ,1998( 8) :26

16、 3014刘冬儿 . 包装与机械 , 2002,23( 10): 79 89analysis of determinationmethods of aftb1ye xuezhuwang xiaolizhao y anshendong xiujin( institute of quality and standard for farm products,zhejiang academy ofagricultural sciences,hangzhou, 310021) )abstractaft p1 is a hard cancenog enic substance, its limitativeindex was raised in manycountriesthe detection limits of determination methods of aftb1 was raised due to it#s toxicity,and have becomenew technical barriers in international tradeseveral determination methodsof aftb1 were described, their characteristics and detection limits were summarily analy