头孢拉定胶囊微生物限度检查法的验证分析

1、头孑包拉定胶囊微生物限度检查法的验证分析 【关键词】微生物限度检查；低速离心-薄膜过滤法；平血法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生 物污染程度的方法。检查项冃包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制 菌检查 1 我们采用常规方法对头抱拉定胶囊进行微生物限度检查 时发现，不仅头抱拉定本身对细菌的强抑制作用影响实验结果，而且头 抱拉定胶囊的某些辅料也对微生物限度检查法产纶定影响，不能有 效地保证实验结果的准确性。我们采用了低速离心-薄膜过滤法和平皿 法相结合的实验方法来进行头抱拉定胶囊微生物限度检查，取得了比 较理想的实验效果。报告如下。 1材料 1.1培养基及试药 营养琼脂培

2、养基（批号：071008）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号: 070329）、 改良马丁培养基 （批号： 061020）、 改良马丁琼脂培养基 （批 号： 060404）胆盐乳糖培养基 （批号： 060913）营养肉汤培养基 （批 号：0611、mug 培养基（批号：060913）、分析纯氯化钠（批号：070725） 试剂。 1. 2菌种 大肠埃希菌 cmcc（b） 44102、 金黄色葡萄球菌 cmcc （b） 26003 枯草芽抱杆菌cmcc（b）63501,白色念珠菌cmcc（b）98001 黑曲 霉cmcc（b）98003,均由江苏省药检所提供。 13主要仪器设备 hh b11 360型屯热

3、恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；dg 2型多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；zf7c型三用紫外分析仪（上 海慧鑫科学仪器有限公司）;yxq ls 75sii型全自动立式压力蒸汽 灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；101 3a鼓风干燥箱 （通州市沪通制药机械设备厂）；hty-2000a集菌仪（杭州泰林医疗器 械厂）；800型离心沉淀器（江苏江阴科研器械厂）。 1.4样品 头砲拉定胶囊,规格：0.25g,批号：071003, 071113, 071201。 生产单位：江苏聚荣制药集团有限公司。 2方法 2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证1 2. 1. 1供试液制备取供试品10g,加ph

4、7. 0无菌氯化钠-蛋白月东缓 冲液 100ml,于 45 c水浴屮保温、浸泡、振摇溶化，制成 1： 10的供 试液。 2.1.2菌液的制备（1）将大肠埃希菌、 金黄色葡萄球菌、 枯草芽抱 杆菌的新鲜培养物 1白金耳分别接种至 10ml营养肉汤培养基中，30 35 c培养 1824h,分别取上述培养物 lml加入 9ml0.9%的无菌氯化 钠溶液内以 10倍递增稀释制成每 lml含菌数 50loocfu的菌悬液。 （2）将口色念珠菌的新鲜培养物 1 口金耳接种至 10ml 改良马丁培养基 中，2328 c培养 2448h,取上述培养物 lml加入 9ml0.9%的无菌 氯化钠溶液内以 10倍递

5、增稀释制成每 ml含菌数 50loocfu的菌悬 液。（3）将黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上， 2328 c培养 57d,使人量抱子产生。加入 0.9%无菌氯化钠溶液 5ml,用无菌玻棒轻轻将施子洗脱，然后用一支管口包有无菌棉花且能 过滤菌丝的 10ml吸管吸出抱子液至无菌试管内，用 0. 9%的无菌氯化 钠溶液稀释再与标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，再逐 步稀释制成每 ml 含抱子数 50loocfu的他子悬液。 2.1.3验证方法本品对细菌生长有强抑制作用， 药典所规定的三 株验证实验用菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌对木品均较为敏感，所以木品的细

6、菌数测定应采用薄膜过滤法。本品为 胶囊剂，由于囊壳中的明胶使供试液在常温下易成凝胶状，而造成取 样困难，滤膜堵塞，所以应注意操作全过程保持 45 c。本制剂中含有 一定量的不溶性辅料，宜采用低速离心-薄膜过滤联合应用。由于本品 对真菌没有抑制作用，进行霉菌及酵母菌计数无需采用薄膜过滤法， 使用常规法（平皿法）即可使口色念珠菌和黑曲霉的回收率达到要求。 2. 1. 3. 1细菌计数方法的验证（低速离心-薄膜过滤联合应用） （1） 供试液的制备。取 1 ： 10的供试液 10ml注入离心管屮，500r/min,离 心5mino取上清液置另一离心管中，加 ph70 无菌氯化钠-蛋白月东缓 冲液至 1

7、0ml。（2）试验组：用少量的稀释剂将薄膜过滤器内的滤膜湿 润。取低速离心后制备的供试液 lml 加丁 ph7. 0无菌氯化钠-蛋白月东缓 冲液 100ml中过滤，再用 400mlph7. 0无菌氯化钠-蛋白月东缓冲液冲洗 滤膜，泵速为 160转，冲洗 3次后将含 50loocfu / ml大肠埃希菌的 菌悬液 lml 加入剩余的 100ml 冲洗液中过滤。取出滤膜菌面朝上，贴 内酰胺酶营养琼脂培养基平板上，3035 c培养 48h。对 金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的验证同法操作。（3）菌液组：分别 取上述稀释的三株验证用菌的菌悬液各 lml,按照平皿菌落计数法测 定其试验菌数。（4）供试品对

8、照组：按“2. 1. 3.1 （2）法（不加试验 菌）操作测定供试品的本底菌数。（5）稀释剂对照组：按 （2）法（用稀释剂代替供试晶）操作对稀释剂进行验证。 于含 2ml b 2. 1.3.2霉菌及酵母菌计数方法的验证（平皿法）（1）试验组： 取1 ： 10的供试液 lml分别加入 4 个平皿内，再依次加入白色念珠菌、 黑曲霉菌悬液 lml （50100cfu/ml）,每株菌平行制备 2个平皿，立 即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，2328 c培养 72ho （2）菌液组：分别 取上述两株稀释的菌悬液各 lml,注入平皿内，立即倾注玫瑰红钠琼 脂培养基，每个菌平行制备 2个平皿，以测定所加的试验菌数。

9、（3） 供试品对照组：取 1 ： 10的供试液 lml,注入 2个平皿内， 立即倾注 玫瑰红钠琼脂培养基，以测定供试品的本底菌数。（4）稀释剂对照组: 本品未用特殊方法处理和制备。 上述方法独立平行实验 3次。 2. 1. 3. 3头鞄拉定胶囊菌落计数回收率测定实验结果头抱拉定胶 囊细菌计数采用低速离心-薄膜过滤联合应用，3次平行试验屮均可使 本品中所污染的三株验证（细菌）用菌的回收率达 70%以上，说明用 本法测定细菌计数结果是正确的。而采用平皿菌数计数法，3 次平行 试验中的两株验证（真菌）用菌的回收率均达 70%以上，说明该法可 用于霉菌及酵母菌计数。实验结果见表 1。表 1 头抱拉定胶

10、囊菌落计 数冋收率测定实验结果 2. 2控制菌检查方法的验证 2. 2. 1供试液的制备（同菌落计数方法验证） 2.2. 2菌液制备分别挑取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培 养物 1白金耳，各接种至 10ml营养肉汤培养基中，3035 c培养 18 24h,取摇匀培养物 lml,用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每 ml 含菌 数 50loocfu的菌悬液。 2. 2. 3大肠埃希菌检验方法的验证 2.2. 3.1试验组取 1 ： 10供试液 10ml经低速离心后制备的供试 液（上清液），参照细菌计数测定方法进行薄膜过滤处理，转膜至含 2nd b内酰胺酶 100ml胆盐乳糖增菌液内，加入含

11、86cfu / ml的大肠 埃希菌菌液 lml, 3537 c 培养 1824h,可见培养基浑浊，有气体产 生。取上述培养液 0. 2ml接种至 5mlmug 培养基的试管内， 培养 5, 24h, 在 366“紫外线下观察，可见蓝白色荧光，滴加靛基质试液，液面呈 玫瑰红色。 2. 2. 3. 2阴性菌对照组取 1 ： 10 供试液 10ml,按2.2.3. 1方 法操作，加入含菌数 75cfu/ml 金黄色葡萄球菌菌液 lml, 3537 c 培养 1824h,培养基无浑浊，无气体产生。取上述培养液 0.2m接 种至 5mlmug 培养基的试管内，培养 5, 24h,在 366nm紫外线下观

12、察, 无蓝白色荧光，滴加靛基质试液，液面呈试剂本色。 2.2. 3.3 验证结果试验组检出了大肠埃希菌，阴性菌对照组未检 出金黄色葡萄球菌，说明头抱拉定胶囊经低速离心-薄膜过滤联合应用 处理后可以消除本品对大肠埃希菌的抑制作用。100ml 胆盐乳糖增菌 培养基可用于本品的人肠埃希菌的检查。 3结论 头他拉定胶囊细菌数测定可采取低速离心-薄膜过滤联合应用的 方法进行；霉菌及酵母菌数测定可用平皿菌落计数法检验；大肠埃希 菌检查时，可取 1 ： 10供试液 10ml,用低速离心-薄膜过滤联合应用 处理后，加入含 2ml b内酰胺酶的 100ml 服盐乳糖增菌培养基进行 增菌培养，依法进行检查。 4讨

13、论 根据中国药典微生物限度检查方法之规定，含抑菌成分的制 剂，必须消除供试液的抑菌活性，然后再进行微生物限度检查。通过 实验，我们认为： (1)本品对细菌生长有强抑制作用，药典所规定的三株实验菌对本 品均较为敏感，所以本品的验证必须采用薄膜过滤法。 rti-t 本品辅料的影响， 容易造成滤膜堵塞， 应首先经过低速离 心(500r/min离心 5min)去除辅料，取上清液经 100ml冲洗液进一步 稀释，才能较顺利地通过滤膜。 验证实验表明，木品按照一般薄膜过滤法处理仍然难以去除头 抱拉定的抑菌活性成分，三株细菌的回收率往往达不到要求。本实验 参照青霉素类系列产品无菌检查中添加 b内酰胺酶加入胆盐乳糖增 菌培养基屮的方法，三株验证菌的回收率均符合要求。 制备含 b 内酰胺酶营养琼脂平板吋应注意控制