化验室作业指导书

1、化验室作业指导书汇编 一、范围目的本汇编资料规定了我公司化验室分析化验工作所采用的方法，用于我公司葡萄酒生产过程中化验室的分析化验。本汇编规定方法的主要目的在于指导化验员的分析化验工作，同时使不同时间的化验结果有一个可比性。二、 引用标准GB2758 发酵酒卫生标准GB15037-2006葡萄酒GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用试验方法三、 技术要求1感官要求葡萄酒的感官要求应符合表1规定。表1项 目要 求外观色泽白葡萄酒近似无色、微黄带绿、浅黄、禾竿黄、金黄色红葡萄酒紫红、深红、宝石红、红微带棕色、棕红色桃红葡萄酒桃红、淡玫瑰红、浅红色加香葡萄酒深红、棕红、浅红、金黄色、淡黄色澄清

2、程度清澈透明，有光泽，无明显悬浮物（使用软木塞封口的酒允许有3个以下不大于1mm的软木渣）起泡程度起泡酒注入杯中时，应有细微的串珠状气泡升起，并有一定的持续性香气与滋味香气非加香葡萄酒具有纯正、优雅、怡悦、和谐的果香与酒香加香葡萄酒具有优美、纯正的葡萄酒香与和谐的芳香植物香滋 味干、半干葡萄酒具有纯净、幽雅、爽怡的口味和新鲜悦人的果香味，酒体完整甜、半甜葡萄酒具有甘甜醇厚的口味和陈酿的酒香味，酸甜协调，酒体丰满起泡葡萄酒具有优美纯正、和谐悦人的口味和发酵起泡酒特有的香味，有杀口力加气起泡葡萄酒具有清新、愉快、纯正的口味，有杀口力加香葡萄酒具有醇厚、爽舒的口味和协调的芳香植物香，酒体丰满典型性典

3、型突出、明确2理化要求2.1酒精度的测定采用国标（GB/T15037-2006，以下同）第三法：1、酒精计法以蒸馏法去除样品中的不挥发性物质，用酒精计测出其温度及相应的酒度。查续表1，求得20时酒精度，用%（体积分数）表示。2、密度瓶法（1）原理以蒸馏法去除样品中的不挥发性物质，用密度瓶法测定馏出液的密度。根据馏出液（酒精水溶液）的密度，查附录A，求得20时乙醇的体积分数，即酒精度，用%（体积分数）表示。（2）仪器分析天平：感量0.0001g 全玻璃蒸馏器：500ml 恒温水浴：精度±0.1 附温度计密度瓶：25ml或50ml（3）试样制备用一洁净干燥的100mL容量瓶准确取100m

4、L（液温20）于500mL蒸馏瓶中，用50mL水分三次冲洗容量瓶，洗液并于蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量瓶作接收器。开启冷凝水，缓慢加热蒸馏，收集馏出液近刻度，取下容量瓶，盖塞，混匀，备用。（4） 分析步骤采用国标方法一： 将密度瓶洗净并干燥，带温度计及侧孔罩称量，重复称量和干燥，直至恒重（M）。 取下温度计，将煮沸冷却至15左右的蒸馏水注满恒重的密度瓶，插上温度计，瓶中不得有气泡，将密度瓶进入20±0.1的恒温水浴中，带内容物温度达20，并保持10min不变后，再用滤纸擦去侧管溢出的液体，使侧管的液面与侧管管口齐平，立即盖好侧孔罩，取出密度平瓶，用滤纸擦干瓶

5、壁的水，立即称量M1。 将密度瓶的水倒出，洗净并使之干燥，然后装满制备试样，按b同样操作，称量M2。（5）计算试样残液在20的密度按（1）、（2）计算 M2M+A2020= _0 （1） M1M+A M1-M A=a . _ (2) 997.0 式中： 2020试样残液在20时的密度 g/L M 密度瓶的质量 g M1 20密度瓶与充满密度瓶蒸馏水的总质量 g M2 20密度瓶与充满密度瓶试样残液的总质量 g 020蒸馏水的密度 （=998.20 g/L） A 空气浮力校正值a 干燥空气在201013.25hpa时的密度值997.0在20时蒸馏水与干燥空气密度之差 g/L根据试样的密度2020

6、查附录A，求得酒精度。所得结果表示至一位小数。2.2 总糖及还原糖的测定 采用国标第二法：直接滴定法（1）原理利用斐林溶液与还原糖共沸，生成氧化亚铜沉淀的反应，以次甲基蓝为指示液，以样品或经水解后的样品滴定煮沸的斐林氏溶液，达到终点时稍微过量的还原糖将蓝色的次甲基蓝还原为无色，以示终点。根据样品消耗量，求得总糖或还原糖的含量。（2）试剂与溶液盐酸溶液（11）；氢氧化钠溶液（200g/L）；标准葡萄糖溶液 2.5g/L：精确称取2.50000g（称准至0.0001g）在105110烘箱内烘干3h并在干燥器中冷却的葡萄糖，用水溶解定容至1000mL。次甲基蓝指示液10g/L：称取1.0g次甲基蓝，

7、溶解于水中，稀释至100mL。斐林氏A液（准确称取69.4g无水硫酸铜，稀释至1000，过滤备用），斐林氏B液（准确称取346g酒石酸钾钠和100gNaOH,稀释至1000，过滤备用）。（3）试样的制备测总糖用试样：准确吸取一定量的样品V1于100mL容量瓶中，使之所含糖重量为0.20.4g，加5mL（11）盐酸溶液，摇匀，加水至20ml，摇匀于68±1水浴上水解15min，取出，冷却，用200g/L的NaOH溶液中和至中性，调温至20，加水定容至刻度V2。还原糖用试样：准确吸取一定量的样品V1于100mL容量瓶中，使之所含还原糖重量为0.20.4g，加水定容至刻度V2。（4） 分析

8、步骤测定干葡萄酒样品或含糖量较低的半干葡萄酒，先吸取一定量样品（V3）（液温20）于预先装有费林溶液A、B各5.00mL于250mL三角瓶中，再用葡萄糖标准溶液操作，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积（V），结果按式（1）计算。预备试验：取斐林氏 A、B液各5.00mL于250mL三角瓶中加水50mL，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴定至蓝色消失。记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。正式试验：取斐林氏A、B液各5.00mL于250mL三角瓶中，加水50mL和比预备实验少1mL的葡萄糖标准溶液加热至沸，并保持2min

9、，加2滴次甲基兰指示液，在沸腾状态下于1min内用制备好的葡萄糖标准溶液滴定至终点。记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积V。以试样代替葡萄糖标准溶液，操作同上。记录消耗试样的体积V3。结果按式（2）计算。（5）计算（所得结果应表示至一位小数） FG×VX3= _ ×1000 (1) (V1/V2) ×V3 FX3= _ ×1000 (2) (V1/V2) ×V3费林溶液A、B各5ml相当于葡萄糖的克数按式（3）计算 m F=_×V (3) 1000式中：X3总糖或还原糖的含量g/L F 斐林氏A、B液各5mL相当于葡萄糖的克数gV1吸取样

10、品体积mLV2样品稀释后或水解定容的体积mLV3消耗试样的体积mLG 葡萄糖标准溶液的准确浓度g/L（5） 结果的允许误差平行试验两次滴定误差不得超过0.05mL。2.3 挥发酸的测定（1）原理以蒸馏的方式蒸出样品中的低沸点酸类即挥发酸，然后用碱标准溶液进行滴定，经过计算与修正，得出样品中挥发酸的含量。（2）试剂与溶液氢氧化钠标准溶液（C(NaOH)=0.05mol/L），按GB601中4.1条配制与标定（取100gNaOH加入100ml水中于胶瓶中静置，取5ml上清液稀释至2000ml。）并准确稀释。（标定：称取120烘干至恒重的领苯二甲酸氢钾0.2g及加50ml无二氧化碳水，加两滴酚酞，滴

11、至粉红色。 m X= _ (V1-V2) _×0.02042m领苯二甲酸氢钾质量gV1氢氧化钠标准溶液用量mLV2空白氢氧化钠标准溶液用量mL0.02042 与1.00ml氢氧化钠标准溶液（C(NaOH)=1.000mol/L）相当的以克表示的领苯二甲酸氢钾的质量）酚酞指示剂（10g/L），按GB603中4.5.22条配制（准确称取1.0g酚酞用95的乙醇稀释至100ml）酒石酸溶液（20%）。（3）仪器、设备符合下述三条要求的任何蒸馏装置，都可用于试验。也可用附录D（参考件）推荐的挥发酸蒸馏装置。A）以20mL蒸馏水为样品进行蒸馏，蒸馏出的水应不含二氧化碳。B）以20mL0.1mo

12、l/L乙酸为样品进行蒸馏，其回收率应大于或等于99.5%C）以20mL0.1mol/L乳酸为样品进行蒸馏，其回收率应大于或等于0.5%（4）分析步骤按仪器要求安装好挥发酸蒸馏装置，吸取适量20样品V和酒石酸溶液在该装置上进行蒸馏，收集100mL馏出物。将馏出物加热至沸，加入2滴酚酞指示液，用氢氧化钠标准溶液滴定至粉红色，30S内不变色即为终点。记下消耗的氢氧化钠标准溶液的体积V1。（5）计算 C ×V1×60.0 X= _ V式中： X 样品中挥发酸的含量（以乙酸计）g/LC 氢氧化钠标准溶液的物质的当量浓度mol/LV1氢氧化钠标准溶液消耗的体积 mL60.0与1.00m

13、L氢氧化钠标准溶液C(NaOH)=1.000mol/L相当的以克表示的乙酸的质量gV 取样体积mL若挥发酸含量接近或超过理化指标，时则需进行修正，修正时，按下式换算：H=X6（U ×1.875+J ×0.9375）式中：H样品中真实挥发酸（以乙酸计）含量g/LX6实测挥发酸含量g/LU游离二氧化硫含量g/LJ结合二氧化硫含量g/L1.875游离二氧化硫换算为乙酸的系数0.9375结合二氧化硫换算为乙酸的系数（6）结果的允许差平行试验测定结果绝对值之差不得超过平均值的5% 。2.4 滴定酸的测定采用国标第二法：指示剂法（1）原理利用酸碱滴定原理，以酚酞作指示剂，用碱标准溶液滴

14、定，根据碱的用量计算滴定酸含量，以试样所含主体酸表示。（2）试剂与溶液氢氧化钠溶液（C(NaOH)=0.05mol/L），按GB601中4.1条配制与标定，并准确稀释；酚酞指示液（10g/L），按GB603中4.5.22配制。（3）分析步骤取调温至20的试样25mL（取样量可根据酒的颜色深浅而增减）置于250mL三角瓶中加入中性蒸馏水50mL，同时加入2滴酚酞指示液，摇匀后立即用氢氧化钠标准溶液滴定至终点，并保持30S内不变色，记下消耗的氢氧化钠标准溶液的体积V1，同时做空白试验。起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒须排除二氧化碳后，再行测定。（4）计算（所得结果表示至一位小数） C ×(V1

15、V0)×S X= _×1000 V2式中： X 样品中的滴定酸的含量（以酒石酸计）g/LC 氢氧化钠标准溶液的物质的当量浓度mol/LV0空白试验消耗氢氧化钠标准溶液的体积mLV1样品滴定时消耗氢氧化钠标准溶液的体积mLV2吸取样品的体积mL S与1.00mL氢氧化钠标准溶液C(NaOH)=1.000mol/L相当的以克表示的试样主体酸的质量。 S酒石酸=0.075 ，S苹果酸=0.067，S柠檬酸=0.064 S草酸=0.045，S硫酸=0.098（5）结果的允许差平行试验测定结果绝对值不得超过0.1g/L 。2.5 游离二氧化硫及总二氧化硫的测定 采用国标第二法：直接碘

16、量法（1）原理利用碘可以与二氧化硫发生氧化还原反应的性质，用碘标准溶液作滴定剂，淀粉作指示剂，测定样品中二氧化硫含量。利用在碱性条件下，结合态二氧化硫被解离出来，再用碘的标准溶液滴定，得到样品中结合二氧化硫含量。反应式如下： I2+SO2+2H2O=2I-+SO42-+4H+（2）试剂与溶液硫酸溶液：1+3；碘标准溶液：C(1/2 I)=0.02mol/L，按GB601中4.9条配制与标定，准确稀释5倍；（准确称取13g碘及35g碘化钾，稀释至1000ml，摇匀，存于棕色瓶中。标定：取10ml碘液于三角瓶中，用0.1mol硫代硫酸钠标定，近终点时加3ml淀粉指示剂，滴定制蓝色消失。C×

17、; (VV2)C(1/2 I2)= _×1000 V1-0.05式中： C(1/2 I2) 碘标准溶液物质的量浓度，mol/LV 硫代硫酸钠标准水溶液用量mLV2 空白硫代硫酸钠标准溶液物质的量浓度，mol/LC1 硫代硫酸钠标准溶液用量mLV1碘溶液用量mL0.05空白中碘溶液用量mL淀粉指示液：10g/L，按GB603中4.5.20条配制（），并加入40g氯化钠。（3）分析步骤A）测游离二氧化硫吸取50.00mL20样品于250mL碘量瓶中，加入小量碎冰块，再加入1mL淀粉指示液，10mL硫酸溶液，用碘标准溶液迅速滴定至淡蓝色，保持30S不变，即为终点。记下消耗碘标准溶液的体积V

18、。以水代替样品，作空白实验，操作同上。B）测总二氧化硫取25.00mL氢氧化钠溶液于250mL碘量瓶中，再准确吸取25.00mL20样品，并以吸管尖插入10%氢氧化钠溶液的方式加入到碘量瓶中，摇匀，盖塞，静置15min后，再加入小量碎冰块、1mL淀粉指示液、10mL硫酸溶液，摇匀，用碘标准溶液迅速滴定至淡蓝色，保持30S不变，即为终点。记下消耗碘标准溶液的体积V。以水代替样品，作空白实验，操作同上。（4）计算所得（结果表示至整数）C× (VV0)×32X= _×1000 V1式中： X 样品中的二氧化硫的含量mg/LC 碘标准溶液的物质的量浓度mol/LV 测定样

19、品消耗碘标准溶液的体积mLV0空白试验消耗碘标准溶液的体积mLV1吸取样品的体积mL32与1.00mL碘标准溶液C(1/2I2)=1.000mol/L相当的以毫克表示的二氧化硫的质量（5）结果的允许误差平行试验测定结果绝对值之差不得超过平均值的10% 。2.6 干浸出物的测定（1）原理用密度瓶法测定样品或蒸出酒精后的样品的密度，然后用其密度值附录C（补充件），求得总浸出物的含量。再从中减去总糖的含量，即干浸出物的含量。（2）仪器 高精度恒温水浴锅 附温度计密度瓶 电子天平（精度0.0001g）（3）试样制备使用国标第三法：蒸酒精的残留液在20时以水定容至100mL，备用。（4）分析步骤采用国标

20、方法一： 将密度瓶洗净并干燥，带温度计及侧孔罩称量，重复称量和干燥，直至恒重（M）。 取下温度计，将煮沸冷却至15左右的蒸馏水注满恒重的密度瓶，插上温度计，瓶中不得有气泡，将密度瓶进入20±0.1的恒温水浴中，带内容物温度达20，并保持10min不变后，再用滤纸擦去侧管溢出的液体，使侧管的液面与侧管管口齐平，立即盖好侧孔罩，取出密度平瓶，用滤纸擦干瓶壁的水，立即称量M1。 将密度瓶的水倒出，洗净并使之干燥，然后装满制备试样，按b同样操作，称量M2。（5）计算试样残液在20的密度按（1）、（2）计算 M2M+A2020= _0 （1） M1M+A M1-M A=a . _ (2) 99

21、7.0 式中： 2020试样残液在20时的密度 g/L M 密度瓶的质量 g M1 20密度瓶与充满密度瓶蒸馏水的总质量 g M2 20密度瓶与充满密度瓶试样残液的总质量 g 020蒸馏水的密度 （=998.20 g/L） A 空气浮力校正值a 干燥空气在201013.25hpa时的密度值997.0在20时蒸馏水与干燥空气密度之差 g/L1.0018020密度瓶体积的修正系数 以2020×1.0018的查附录C（补充件），得出总浸出物的含量（g/L）所得结果保留一位小数。（6）结果的允许差平行试验测定结果绝对值之差不得超过0.5g/L 。2.7 总酚的测定方法一、 原理葡萄酒中的酚类

22、物质不仅源于葡萄本身而且还来自于陈酿中木桶的浸提物或特殊的添加剂，酚类物质对酒的颜色、风味有一定的影响，另外酚类化合物还是氧化还原物的储蓄器和褐色基质的来源。酒中的酚类物质有许多种，如Drawert 和Tokai酒中曾发现有58种不同的酚类化合物。测定总酚的方法有重金属沉淀法、加有机物沉淀法、还有控制条件氧化法、用各种试剂形成有色产物而进行比色测定。用Folin _ciocalteu试剂进行比色测定，是近年被AOAC规定测酚的一种方法，此方法是利用强氧化剂使酚氧化后的颜色变化，或氧化剂被还原后的颜色变化而进行测定的。二、仪器（1）、分光光度计（2）、恒温水浴三、试剂：1、Folin _cioc

23、alteu试剂。称取100克钨酸钠和25克钼酸钠，将二者溶解于700ml水中，到入2升圆底烧瓶中，再加入50ml 85%磷酸和100ml浓盐酸，给烧瓶上连接一个回流冷凝器，回流10小时（不一定连续），回流后用50ml水冲洗冷凝器，然后取下，加150克硫酸锂和几滴溴，在通风橱中煮沸15分钟，最后颜色应该是黄色（不带丝毫的兰色），冷却后转移到1升的容量瓶中用水定容，过滤并储存于一个棕色瓶中备用。2、20%碳酸钠溶液。称取200克无水碳酸钠，溶于1升沸水中，用水定溶，冷却到室温，24小时后过滤。3、酚母液。称取0.500克干没食子酸(在120下烘干3个小时)，用水溶解，定溶于100ml的容量瓶中备用

24、。四、操作 1、标准曲线的制备： （1）、吸取原酚母液1ml于100ml容量瓶中定容。分别吸取稀释后的酚母液0、1、2、5、10 ml分别置于100 ml容量瓶中用水定溶。 （2）从上各种浓度的酚母液中各吸取1 ml，分别置于100 ml容量瓶中，每瓶加60 ml水，Folin _ciocalteu试剂5 ml，充分混合。 （3）在30秒后，8分钟前加15 ml20%碳酸钠溶液，用水定溶至刻度。 （4）将此液在20下放置2小时，然后用1cm的比色杯测定各自在765nm波长下的光吸收值。并以相应浓度画出曲线。2、样品的测定：对白葡萄酒，吸0.5ml或1ml样品液于100的容量瓶中，加入60水，加

25、Folin _ciocalteu试剂5 ml，其他操作与标准曲线制备步骤中的（3）、（4）相同。对于红葡萄酒，吸取0.1ml0.5ml酒样于容量瓶中加入60水，加Folin _ciocalteu试剂5 ml，其他操作与标准曲线制备步骤中的（3）、（4）相同。五、举例做标准曲线，得标准曲线方程浓度（mg/l）吸光值000.50.04010.1012.50.27350.516 六、说明 1、 糖含量影响酚的测定可用下表修正，但对于干葡萄酒和近干酒不必进行修正糖浓度 用下列系数除总酚含量 1.0-2.5 1.03 2.5-10.0 1.06 10.0-20.0 1.102、取样0.1ml，酒样总酚浓

26、度为标准曲线所得值乘以1000，单位mg/l；取样0.5ml，总酚浓度为标准曲线所得值乘以200单位mg/l；取样1ml，总酚浓度为标准曲线所得值乘以100，单位mg/l。2.8 单宁的测定一、原理 单宁类化合物在碱性溶液中，将磷目酸和磷钨酸盐类还原成蓝色化合物，蓝色的深浅程度与单宁含酚基的数目成正比，如试样中含有其他酚类化合物或其他可还原物质，也会同时测定，因此这一方法有称总多酚的测定。二、仪器（1）、分光光度计（2）、恒温水浴三、试剂 1、福林丹尼斯（Folir-denis）试剂在750ml水中加入100g钨酸钠、20g磷目酸以及50ml磷酸，回流2h冷却稀释至1000ml。 2、碳酸钠饱

27、和溶液 每100ml水中加入20g无水碳酸钠，在7080溶解放置过夜，次日加入少许十水碳酸钠到此溶液中做晶种，使结晶析出，用玻璃棉过滤后备用。若温度过高可将该溶液放入低于20的环境中降温，以使结晶析出。 3、单宁酸的储备溶液，称取0.500g单宁酸（120下烘干3个小时）定溶至100ml的容量瓶中。四、操作 1、标准曲线的制备吸取单宁酸的储备液1ml于100ml容量瓶中定容。制成单宁酸的标准液；吸取0、0.5、1.0、1.5、2.5、5.0、7.5、10ml的单宁酸标准溶液分别放入成有70ml水容量瓶中，加入福林丹尼斯（Folir-denis）试剂5ml及饱和碳酸钠10ml，加水至刻度，充分混

28、匀，30min后以空白做参比在波长760nm处测定吸光度，并以相应的浓度作标准曲线。 2、试样的测定吸取0.1ml红葡萄酒或1ml白葡萄酒试样置于盛有70ml水的100ml容量瓶中，加入5.00ml福林丹尼斯（Folir-denis）试剂及10.00ml饱和碳酸钠溶液，加水至刻度，充分混匀，30min后以空白做参比在波长760nm处测定吸光度，由吸光度从标准曲线查出相应的单宁含量。五、举例做标准曲线浓度（mg/l）吸光值000.250.0270.50.0470.750.0641.250.0982.50.233.750.28850.378做标准曲线，得标准曲线方程：六、说明1、本法在室温显色25

29、min后颜色达最大深度，且于3h内稳定，在波长650nm处与在760nm处比色，结果基本相同。2、单宁酸标准液，应用纯干品。3、取样量为0.1ml，单宁浓度浓度为标准曲线所得值乘以1000，单位mg/l；取样量为0.5ml，单宁浓度为标准曲线所得值乘以200，单位mg/l；取样量为1ml，单宁浓度为标准曲线所得值乘以100，单位mg/l。2.9 色度一、试剂磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液（1）0.2M磷酸氢二钠，称取磷酸氢二钠35.61g溶于1000ml蒸馏水中。（2）0.1M柠檬酸，称取柠檬酸21.01g溶于1000ml蒸馏水中。二、仪器（1）：pHS3CpH计（2）：751分光光度计三、方法红葡萄

30、酒经过0.45m孔径的滤纸过滤，测其pH值,用相同pH磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液（A与B按一定比例混合即得）以1：10冲淡葡萄酒（即1份酒，9份缓冲液）。取稀释以后的葡萄酒放于1cm比色杯中，在分光光度计波长420nm、520nm和620nm下分别测定其吸收值，三者之和即为该红葡萄酒的色度表示数值。3.0 花色苷pH示差法测定花色苷：（1）、原理：利用花色苷及黄酮的结构特性，当pH值为1.0时在520nm处二者均有最大吸收峰，而当pH值为4.5时，花色苷转变为无色查尔酮形式，在520nm处无吸收。用示差法计算溶液中总花色苷含量。（2）、操作：取2ml样品，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲液稀

31、释至20mL，室温下放置1小时（稀释倍数可根据实际情况而定），以2mL溶剂加18mL相应缓冲液作空白，在520nm处测定吸光值。按下式计算溶液中总花色苷(以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计)（3）、计算：花色苷含量（mg/L）= 其中：=(A520 A700)pH1.0 (A520 A700)pH4.5 MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔分子质量，449.2g/molDF为稀释倍数为为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数， 26900。L为比色皿光路长( cm)，1cm。（4）、试剂pH 4.5的缓冲液的制备：准确称取164 g NaAc用蒸馏水定容至100 mL，用盐酸调pH(4.5±0.1)。pH