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文档简介

1、小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数实验时间：实验地点：实验人：1 实验原理小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域，所以富含各类免疫细胞。免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构， 对于膨胀的耐受能力较差， 因此绝大部分就会涨破， 受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方法。2 实验材料：1) 健康小鼠2) 手术器械（剪刀、镊子） 、解剖板3) 70%乙醇4) PBS缓冲液、红细胞裂解液（ ACK）5) 0.2%台盼蓝6) 细胞计数板、计数

2、器7) 离心机8) 显微镜3 实验方法：3.1 取小鼠脾脏将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。3.2 制备单个核细胞悬液将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中， 然后再置于尼龙指套中， 用针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（ 15ml）中，以 1500rpm 离心 10min，弃去上清液， 加入 ASK至 2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置 2min，以破坏红细胞。然后加入 PBS缓冲液至 10ml，以 1500rpm离心 10min。弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾

3、脏单个核细胞悬液。3.3 计算细胞浓度稀释十倍，随机选取一个大方格计数细胞计数为 324 个，计算细胞浓度为324×104 ×10=3.24×107/ml3.4 计算细胞活力在总计为 324 个细胞中计数，死亡细胞有16 个，计算细胞活力为：324- 16/324 ×100%=95.1%在理论范围之内4 实验结果4.1 研磨脾脏得到细胞悬液本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内， 置于少量 PBS液中缓慢研磨， 获得细胞悬液。实验中，我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织， 操作中会有结为絮状团块的结缔组织。 这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起， 去除十分

4、麻烦，而且会损失细胞。 应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去 （这样损失的细胞比较少，造成较小的误差） 。研磨脾脏时的力度、 时间、温度都会影响细胞的活性。 所以应置于冰上快速、轻柔地研磨， 置于液体中避免干磨。 我们在实验室室温下碾磨， 造成细胞破碎较多，影响最终实验结果。4.2 白细胞计数在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题 : 起初，我们小组能够在镜下观察到细胞， 但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。 后来我们意识到，这可能是因为充池后立即观察，细胞还悬浮在液体中， 和方格线不在同一个平面上。 静置 2 分钟后再调焦观察， 只能隐约看到方格线。 在反复调试中发现，减小光圈并降低光源亮度可以增加方格线的清晰度。另外，一定要注意在充池前对计数板的清

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