RealtimePCR原理和应用学习课程

1、提纲l实时荧光定量PCR原理l实时荧光定量PCR的定量方法l平台定量PCR仪器介绍第1页/共26页第一页，编辑于星期六：十八点 四十三分。实时荧光定量PCR的定义 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法第2页/共26页第二页，编辑于星期六：十八点 四十三分。与普通PCR的区别l普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析l实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量第3页/共26页第三页，编辑于星期六：十八点 四十三分。起点定量和终点定量l起始DNA量是“天然”的量，更有意义；终点D

2、NA量是经过PCR“加工”后的量，存在部分失真l起点定量重现性好，终点定量误差较大第4页/共26页第四页，编辑于星期六：十八点 四十三分。扩增曲线：四个阶段 对数图谱第5页/共26页第五页，编辑于星期六：十八点 四十三分。扩增曲线：四个阶段 线性图谱第6页/共26页第六页，编辑于星期六：十八点 四十三分。一些主要概念什么是基线？基线就是扩增曲线中的水平部分 线性图谱 对数图谱第7页/共26页第七页，编辑于星期六：十八点 四十三分。l荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是基线荧光信号的标准偏差的10倍lCT值：是每个反应管内

3、的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数l拷贝数：DNA（包括质粒）拷贝数通常指生长在标准的培养基下每个细菌或者细胞中所含有的DNA分子的数目一些主要概念第8页/共26页第八页，编辑于星期六：十八点 四十三分。基线和域值第9页/共26页第九页，编辑于星期六：十八点 四十三分。CT值第10页/共26页第十页，编辑于星期六：十八点 四十三分。标准曲线 由此可见， Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比 第11页/共26页第十一页，编辑于星期六：十八点 四十三分。荧光定量PCR化学原理 SYBR Green I 荧光染料 TaqMan探针第12页/共26页第十二页，编辑于星期六：十八点 四十三分。lS

4、YBR Green I是一种只与双链DNA小沟结合的染料lSYBR Green I只有和双链DNA结合后才发出荧光，变性时DNA双链分开，无荧光l 在延伸结束阶段采集荧光信号SYBRGreenI荧光染料第13页/共26页第十三页，编辑于星期六：十八点 四十三分。SYBRGreenI工作原理 变性 退火 延伸l每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去，染料一结合，就产生荧光信号l信号强度与DNA分子总数目成正比第14页/共26页第十四页，编辑于星期六：十八点 四十三分。SYBR Green I 荧光染料法的优缺点l优点：1、对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA 2、不必设计复杂探针

5、3、价格便宜l缺点：1、容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 2、对引物特异性要求较高第15页/共26页第十五页，编辑于星期六：十八点 四十三分。TaqMan探针法l 5端标记有荧光报告基团（Reporter，R） ，如FAM、 VIC等l 3端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q）l 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧 光，R与Q分开，则发出荧光l Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针第16页/共26页第十六页，编辑于星期六：十八点 四十三分。TaqMan探针法工作原理第17页/共26页第十七页，编辑于星期六：十八点 四十三分。l每产生一条DNA链，就切断一条探针l每

6、切断一条探针，就产生一个单位信号l信号强度与结合探针的DNA分子数成正比TaqMan探针法工作原理第18页/共26页第十八页，编辑于星期六：十八点 四十三分。l优点：1、对目标序列的高特异性 2、引物设计相对简单 3、重复性比较好l缺点：1、只适合一个特定的目标 2、价格昂贵TaqMan探针法的优缺点第19页/共26页第十九页，编辑于星期六：十八点 四十三分。如何对未知拷贝数的模板进行定量第20页/共26页第二十页，编辑于星期六：十八点 四十三分。平台PCR仪介绍Rotor-Gene 6000特征：36孔（0.2mlPCR管）或者72孔（特殊0.1mlPCR管），离心式检测第21页/共26页第二十一页，编辑于星期六：十八点 四十三分。平台PCR仪介绍Applied Biosystems 7500特征：可以使用96孔板，样品量大，也可以使用8连管第22页/共26页第二十二页，编辑于星期六：十八点 四十三分。PCR扩增原理第23页/共26页第二十三页，编辑于星期六：十八点 四十三分。Real-time PCR探针工作原理第