21植物组织与细胞培养技术学习课程

1、第二章 植物组织与细胞培养第1页/共136页第一页，编辑于星期五：二点 二十九分。一、 植物组织培养定义 是指在无菌的条件下，将离体的植物是指在无菌的条件下，将离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞、胚胎、原生质体细胞、胚胎、原生质体等培养在人工配制的培养等培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤，基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤，长成新的完整植株的一种实验术。长成新的完整植株的一种实验术。第2页/共136页第二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 1、探索阶段（20世纪初至20世纪30年代） 1902年，德国植物学家哈伯兰德（Haberlanclt）就预言，植物细胞具有

2、全能性，即高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体植物活细胞具有能够发育成为完整植株的潜在能力。 而且进行了相关实验：培养植物叶片细胞。 因此，被称为 植物组织培养的father二二 、发展历史、发展历史第3页/共136页第三页，编辑于星期五：二点 二十九分。v2、奠基阶段（20世纪30年代中至50年代未）两个重要发现：1、认识了B族维生素对植物生长的重要意义； 2、发现了生长素是一种天然的生长调节物质。1933年我国的李继侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳提取物加入培养基，获得成功。1934年Went 发现了生长素。随后相继发现了吲哚丁酸、萘乙酸和2，4-D等。

3、B簇维生素。1934年，美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的培养首次获得了真正的成功。（培养基：无机盐、酵母提取物和蔗糖，后来用3种B族维生素：吡哆醇、硫胺素和烟酸取代酵母浸提物获得成功）1934年Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现培养基中加了B族维生素和IAA后，形成层的生长明显增加，揭示了B族维生素和IAA在植物组织培养中的作用，直接导致了1939连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。1939年Nobecourt的胡萝卜也建立了连续生长的培养物。 故三人被誉为植物组织培养的奠基人。第4页/共136页第四页，编辑于星期五：二点 二十九分。 1943

4、年,white 正式提出了植物细胞具有全能性的学说. 1948年，Skoog和催澄在烟草茎段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而诱导形成芽，从而确定了腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。 1956年，Miller发现了激动素后，用它代腺嘌呤的效果更好。 1958年，在美国工作的英国人Stewward，从胡萝卜愈伤组织和细胞培养中，诱导分化产生了个体植株，给“全能性”理论以科学论证。第5页/共136页第五页，编辑于星期五：二点 二十九分。3、迅速发展阶段（20世纪60年代至现在）1960年，Cocking用真菌纤维素酶在番茄

5、幼根分离得到大量活性原生质体，开创了植物原生质体和体细胞杂交研究工作。Kanta在植物试管受精研究中首次获得成功。1960年，Morel用兰花茎尖培养实现了脱去病毒和快速繁殖方面已获成功，导致欧洲、美洲和东南亚等许多国家兰花工业的兴起。（茎尖-原球茎-小植株）1962年Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成，这就是目前我们常用的MS培养基。1964-1966年，印度的Guha和Maheshwari成功地在毛叶曼佗罗花药培养中由花粉诱导得到了单倍体植株。1970年Power首次成功实现原生质体融合。1971年Takebe等首次由烟草原生质体获得再生植株，这一成功促进

6、了体细胞杂交技术发展，同时也为外源基因导入提供了理想的受体材料。1972年，Carlson等通过原生质体事例首次获得了两个烟草物种的体细胞杂交种。1978年Murashige提出了人工种子的概念。20世纪80年代初，随着土壤农杆菌成功的用于植物遗传转化，植物基因工程开始成为研究的热点。1983年Zambryski首次用农杆菌转化烟草，获得首例转基因植物。第6页/共136页第六页，编辑于星期五：二点 二十九分。 三、特点三、特点 1.培养条件可人为控制 2.生长周期短繁殖率高 3.管理方便，利于自动化 4.4.遗传品质一致 5.培养材料经济 6.误差小、重复性强第7页/共136页第七页，编辑于星

7、期五：二点 二十九分。四、意义和应用四、意义和应用（1 1）能够有效保持优良品种特性）能够有效保持优良品种特性（2 2）获得无病毒植株）获得无病毒植株（3 3）快速繁殖新品种，加速优良品种推广）快速繁殖新品种，加速优良品种推广（4 4）节约耕地，提高农民产品产出率）节约耕地，提高农民产品产出率（5 5）在遗传、生理生化和病理等研究上的应）在遗传、生理生化和病理等研究上的应用用（6 6）便于运输与种质资源保存）便于运输与种质资源保存第8页/共136页第八页，编辑于星期五：二点 二十九分。五 、 实验室、设备要求和实验室设计第9页/共136页第九页，编辑于星期五：二点 二十九分。 植物组织培养是在

8、无菌无菌的条件下进行离体植物材料培养的技术。要达到无菌无菌操作和无菌无菌培养，首先首先是要有一定的无菌无菌环境，使用无菌无菌的容器和用具（经过灭菌处理的）进行无菌无菌操作，将无菌无菌的植物材料接种在无菌无菌的培养基上，把要培养的植物材料放在一定的温度、湿度、光照、营养条件下，使其生长、发育和繁殖，这就必须要有一定的设备和条件。第10页/共136页第十页，编辑于星期五：二点 二十九分。5 51 1 植物组织培养室的基本结构植物组织培养室的基本结构 选址：选址： 在建造植物组织培养室时，应选择采光好、通风好、环境干净的地点，以利于组织培养的顺利进行和降低培养过程的污染率。 实验室：实验室：植物组织

9、培养工作的开展除需要培养室外，还应该有与之配套的洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、细胞学实验室、暗室和物品存放室等。第11页/共136页第十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。 第12页/共136页第十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （2 2）药品贮藏室）药品贮藏室 要求干燥、通风，避免光照，有存放各种药品试剂的药品柜、冰箱等设备，化学试剂、玻璃器皿等物品分类存放于柜中，有毒物品（HgCl2）需要专人密封保存，需低温保存的药品和药液放置于冰箱中贮藏，药品贮藏室紧邻化学称量室较好，便于工作。第13页/共136页第十三页，编辑于星期五：二点 二十九分。第14页/共

10、136页第十四页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （4 4）培养基配制室）培养基配制室 主要进行培养基的配制、分装和灭菌前的暂时存放。配制的培养基需要实验台，上下水，电源，加热设备等。 配制培养基室要求备有各种试管、三角瓶、烧杯、量筒、吸管等玻璃器皿，有安放药品和器皿的各种橱架、水浴锅、过滤灭菌装置和酸度计等。 规模较小时， 可与洗涤室合并在一起。第15页/共136页第十五页，编辑于星期五：二点 二十九分。第16页/共136页第十六页，编辑于星期五：二点 二十九分。第17页/共136页第十七页，编辑于星期五：二点 二十九分。第18页/共136页第十八页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （8 8

11、）接种室）接种室第19页/共136页第十九页，编辑于星期五：二点 二十九分。第20页/共136页第二十页，编辑于星期五：二点 二十九分。2021-11-2021第21页/共136页第二十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。第22页/共136页第二十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。（1010）细胞学实验室）细胞学实验室 第23页/共136页第二十三页，编辑于星期五：二点 二十九分。第24页/共136页第二十四页，编辑于星期五：二点 二十九分。第25页/共136页第二十五页，编辑于星期五：二点 二十九分。第26页/共136页第二十六页，编辑于星期五：二点 二十九分。第27页/共136页第二十七

12、页，编辑于星期五：二点 二十九分。第28页/共136页第二十八页，编辑于星期五：二点 二十九分。 果酱瓶或罐头瓶果酱瓶或罐头瓶 。 培养皿培养皿 在无菌在无菌材料分离、滤纸灭菌、种子发芽、材料分离、滤纸灭菌、种子发芽、病毒鉴定病毒鉴定时较常用，其规格有直径时较常用，其规格有直径6cm6cm、9cm9cm、12cm12cm的。固体平板培养一般采用直径的。固体平板培养一般采用直径6cm6cm的小型培养皿。的小型培养皿。此外，可以用培养皿室内催芽，以供培养时取材之用。此外，可以用培养皿室内催芽，以供培养时取材之用。在无菌室还可以在培养皿中在无菌室还可以在培养皿中解剖茎尖、分离花粉、切解剖茎尖、分离花

13、粉、切割继代培养物及其他外植体或培养材料割继代培养物及其他外植体或培养材料。第29页/共136页第二十九页，编辑于星期五：二点 二十九分。 植物组织培养专用容器植物组织培养专用容器 瓶口包扎瓶口包扎，第30页/共136页第三十页，编辑于星期五：二点 二十九分。第31页/共136页第三十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （B B） 盛装器皿盛装器皿 盛装容器主要是存放各种试剂和药液。 磨口瓶磨口瓶 包括无色和棕色两类，细分为广口瓶、细口瓶，规格有1000mL、500mL、250mL、125mL，广口瓶用于存放试剂，细口瓶用来分装配制好的各种母液。不易保存的母液存于冰箱中低温保存，见光易分解的

14、药品可用棕色瓶安全保存。 滴瓶滴瓶 盛装一定浓度的酸液或碱液，用于调节培养基的pH值。其中碱液用塑料滴瓶更好。第32页/共136页第三十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 搪瓷锅（盆）或不锈钢锅（盆）搪瓷锅（盆）或不锈钢锅（盆） 用于配制和熬制培养基，研究可用较小的规格，如1000mL规格的搪瓷缸，或4000mL规格的搪瓷锅，生产上要选较大的规格，如8000mL或更大规格的不锈钢锅较好，可提高劳动效率。 烧杯烧杯 规格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各种母液和培养基。 （C C） 计量器皿计量器皿 计量器皿要求有准确的刻度，以便于在配制各种母液及培养基时

15、能准确定量，减少实验误差。 容量瓶容量瓶 规格有1000mL、500mL、250mL、125mL、50mL，用于配制各种母液时定容。第33页/共136页第三十三页，编辑于星期五：二点 二十九分。 刻度吸管刻度吸管 又叫移液管又叫移液管，规格有10mL、5mL、1mL、0.5mL、0.2mL、0.1mL。用于吸取各种母液。 量筒量筒 规格有1000mL、500mL、250mL、100mL、50mL、25mL 、10mL、5mL，用于配制不同浓度的酒精和配制培养基时吸取大量元素母液等。 （D D）其他）其他 除以上各种容器外，还应具备一些其他玻璃器皿，如漏斗、称量瓶、玻璃棒等，以便用于培养基的制备

16、等工作。有条件时，还可以配备培养基分装器，由大型滴管、漏斗、橡皮管及铁夹等构成。此外，还有量筒式分装器，上有刻度，下有橡皮管及铁夹控制。微量分装可用注射器。第34页/共136页第三十四页，编辑于星期五：二点 二十九分。第35页/共136页第三十五页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （2 2）仪器与设备）仪器与设备 天平天平 可以根据实际需要配备选择如下称量仪器。天平应放在干燥，避免震动，无腐蚀性药品的地方，应尽量避免移动，天平匣内应放硅胶或其他中性干燥剂以保持干燥。 （A A） 药物天平药物天平称量精度为0.1g，用来称取蔗糖和琼脂等。 （B B） 扭力天平扭力天平 既移动方便，又较为灵敏的称

17、量仪器，可弥补药物天平和分析天平各自的不足，精度为0.001g，而且在1g 内的物品不用加砝码，故使用方便。 （C C） 分析天平分析天平 精度为0.0001g，用来称取微量元素和植物生长调节物质及微量附加物。选择平稳，干燥，没有腐蚀性药品和水气的地方放置天平。第36页/共136页第三十六页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （D D） 电子天平电子天平 精度高、称量快、但价格较高。 冰箱冰箱 分普通冰箱和低温冰箱。某些试剂、药品和母液需低温保存；有些材料需低温处理。一般备有家庭用冰箱即可。 烘箱和恒温箱烘箱和恒温箱 洗净后的玻璃器皿，如需迅速干燥，可放在烘箱内烘干，温度以80100为宜。若需要

18、干热灭菌，温度升高至150180，持续13h即可。在进行培养物的干重分析时，可在80条件下烘干。 恒温箱即可用于植物原生质体和酶制剂的保温，也可用于组织培养中暗培养。恒温箱内装上日光灯可进行温度及光照方面的小型实验。第37页/共136页第三十七页，编辑于星期五：二点 二十九分。 显微镜显微镜 一般用双目体视显微镜较多，用于剥取茎尖以及隔瓶观察内部植物组织生长情况。同时也还要有生物显微镜，用以观察花粉发育时期及培养过程中细胞核的变化等。此外，倒置显微镜可以从培养器皿的底部观察培养物，因此，在液体培养时，可用倒置显微镜进行观察。 酸度计（酸度计（pHpH试纸也可）试纸也可） 培养基中的pH值十分重

19、要，因此，在配制培养基时，需要用酸度计测定和调整。一般用小型酸度测定仪，既可在配制培养基时使用，也可测定培养过程中pH值的变化。若不做研究，仅用于生产，也可用精密pH47的试纸来代替。测定培养基pH值时，应注意搅拌均匀后再测。第38页/共136页第三十八页，编辑于星期五：二点 二十九分。 蒸馏水器蒸馏水器 水中常含有无机和有机杂质，如不除去，势必影响培养效果。植物组织培养中常使用蒸馏水或去离子水，蒸馏水可用金属蒸馏水器大批制备，要求更高的用硬质玻璃蒸馏水器制备。去离子水是用离子交换器制备的，成本低，但不能除去水中有机成分。一般生产性的组培育苗，对水要求不太高，除配制各种母液用蒸馏水或去离子水外

20、，配制培养基所用水可以用自来水代替，如果当地水质较硬，可以用煮沸过并沉淀去杂质后的白开水，以降低生产成本。 空调器（空气调节器）空调器（空气调节器） 夏季高温不利于试管苗生长繁殖，常常造成组培苗生长不良，或引起玻璃化等不良反应，需要购置空调器降温，空调器功率应根据培养室大小来定。第39页/共136页第三十九页，编辑于星期五：二点 二十九分。第40页/共136页第四十页，编辑于星期五：二点 二十九分。 超净工作台超净工作台 如有条件购置先进设备超净工作台，既方便，又舒适，无菌效果又好，它可代替无菌室和接种箱。超净工作台原系工业用于半导体元件与精密仪器仪表的装置，现已成为植物组织培养上最常用、最普

21、及的无菌操作装置。它有单人、双人、及三人式的，也有开放和密封式的。超净工作台一般较宽，购置和设计房屋时应注意，以防房门太窄而搬不进去。超净工作台主要是通过风机，将送入的空气经过细菌过滤装置，再流过工作台面。因此超净工作台应放置在空气干净、地面无灰尘的地方，以延长使用期。使用过久，引起堵塞，需要清洗和更换过滤器。第41页/共136页第四十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。第42页/共136页第四十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 培养架培养架 进行固体培养和试管苗大量繁殖时，需要有放置培养瓶的培养架。制作培养架时应考虑使用方便、节能、充分利用空间以及安全可靠。架子可用金属、木材制作，隔板可

22、用玻璃、木板、纤维板、金属板等，最好用平板玻璃或铁丝网，既透光，上层培养物又不受热。 这里介绍一种效果好、容量大、使用较安全、较适用的培养架培养架，立柱用直径30 mm左右的钢管，横架用25 mm角钢焊制而成，灯座装于每层两侧的横架上，其上有槽，用于固定灯座。每层装40 W日光灯23个，镇流器最好装于室外以利于散热。也可在两端横架下方68 cm另装一横档，其上装灯座和启动器。第43页/共136页第四十三页，编辑于星期五：二点 二十九分。 还有一种叫为万能角铁的配件，其长度为3 m，可切割成不同长度的配件，用于组装培养架。此种培养架可以任意组装，并且造价较低。 1根万能角铁原料售价一般在20元人

23、民币，1个培养架用10 根，加上螺丝等小型配件，1个培养架造价在300元以内，较由其他的原料制成的培养架成本低。 木制和铝制造价和铁制的造价均在500元以上，并且显得笨重，特别是木制的容易发生火灾。第44页/共136页第四十四页，编辑于星期五：二点 二十九分。 灭菌装置灭菌装置 高压蒸汽灭菌锅是最基本的设备，用于培养基、器械等的灭菌。有大型卧式、中型立式和小型手提式等多种，可按生产规模来选用，大型效率高、小型方便灵活。 小型手提式有内热式和外热式两种，内热式加热管在锅内，省时省电，但不能用火炉加热；外热式可用电炉、煤炉、煤气等加热。 手提式内热小型高压灭菌锅配一个3 kw调压变压器和定时钟，可

24、实现半自动灭菌，并省电40%。 此外，应有紫外线灯、水浴锅、室内小推车、振荡培养机和旋转培养机及其他培养装置。第45页/共136页第四十五页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （3 3）用具和器械）用具和器械 组织培养所需要的用具和器械，可选用医疗器械和微生物实验所用的器具。常用的用具和设备如下。 镊子镊子 小型尖头镊子，适用于摄取植物组织和分离茎尖、叶片表皮等。长1625cm的枪形镊子，腰部弯曲，使用方便，可用于接种和转移植物材料。第46页/共136页第四十六页，编辑于星期五：二点 二十九分。 剪刀剪刀 常用的有解剖剪和弯头手术剪，一般用于试管内剪取茎段，进行继代培养的转接。在剪取外植体时，特

25、别是木质化程度较高的枝条常用剪枝剪（修枝剪），在果树组织培养中，枝条修整时也需要修枝剪。 解剖刀和芽接刀解剖刀和芽接刀 常用的解剖刀，有长柄和短柄两种。刀头也有双面和单面之分，可以经常更换。对大型材料如块茎、块根等需用大型解剖刀。果树的枝芽常需要芽接刀。 接种工具接种工具 包括接种针、接种钩及接种铲，由白金丝或镍丝制成，用来接种花药或转移植物组织。 钻孔器钻孔器 取肉质茎、块茎、肉质根内部的组织时使用。钻孔器一般做成T形，口径有各种规格。第47页/共136页第四十七页，编辑于星期五：二点 二十九分。第48页/共136页第四十八页，编辑于星期五：二点 二十九分。 细菌过滤器细菌过滤器 溶液中有些

26、生长调节物质以及有机附加物质，如吲哚乙酸等，在高温条件下易被分解破坏，可用细菌过滤器来除菌。可采用金属制的蔡氏漏斗，以石棉微孔滤膜（孔径为0.45m）除去细菌。在过滤较少量的液体时，宜用醋酸纤维素或硝酸纤维素物质制成的微孔滤膜，其孔径为0.45m。这种滤膜在氧气存在下，能经受125高温灭菌。在过滤灭菌时需要一套加压（注射器）或减压吸滤设备，漏斗下接吸滤瓶，吸嘴处接上一只内装脱脂棉的滤气玻璃管。 第49页/共136页第四十九页，编辑于星期五：二点 二十九分。 注射器注射器 普通的皮下注射器头上安装滤板夹，其上有0.45m滤板，构成一个微孔滤板微量注射器。可用来过滤灭菌，也可以用于微量悬滴培养中的

27、营养液的分装。 其他其他 灼烧工具用的酒精灯、用于溶解培养基的带有磁搅拌器的电炉、用于加速溶解大量琼脂培养基的微波炉、用于贮备无离子水和重蒸馏水的大型塑料桶、试管架以及转移培养瓶、试管架的搪瓷盘或小铁篮等。第50页/共136页第五十页，编辑于星期五：二点 二十九分。 另外，可以根据培养效果的好坏和成本的高低选用适当的瓶塞和外罩。一般试管和烧瓶可用未经脱脂的棉花塞（有时包上纱布或粗布），亦可用泡沫塞子或铝箔塞。铝箔也用以包裹棉塞和泡沫塞，也可以用能经受高压灭菌的塑料盖。近年来，有一种透明的、可进行高压消毒的封口薄膜，既防止污染，又可使空气透过，并有良好的透光作用。 预先灭菌的或经过高温灭菌的培养

28、器皿也可用帕拉胶片（parafilm）密封，该胶片是一种蜡制的、不能进行高温灭菌、可伸展的黏性薄片或胶带。也有只用两三张羊皮纸或其他纸来包扎瓶口。第51页/共136页第五十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。六 培养基的配制、灭菌及操作技术植物组织培养成功与否，一方面取决于培养材料本身的性质,另一方面取决于培养基的种类和成分，所以组织培养的发展与培养基的改进是分不开的。不同的植物材料对培养基的要求不同，因而必须根据不同的植物材料对培养基的要求不同，因而必须根据不同的植物材料以及不同的培养目的选择合适的培养不同的植物材料以及不同的培养目的选择合适的培养基，并按照不同的培养阶段加入适当的添加物。基

29、，并按照不同的培养阶段加入适当的添加物。作为主要碳源的蔗糖、支撑物琼脂的浓度及培养基的pH值都会影响外植体和培养材料的生长和发育。第52页/共136页第五十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 培养基通常有两个水平（或两个组成部分）培养基通常有两个水平（或两个组成部分） 一、是基本培养基一、是基本培养基，包括大量元素和微量元素（无机盐类），维生素和氨基酸，还有糖和水等。迄今为止，基本培养基已有几百种，但较常用的仅一二十种，如MS、改良MS、White、Nitsch、N6、B5等基本培养基。 二、是完全培养基二、是完全培养基，即在基本培养基的基础上，根据各种不同试验要求，附加一些物质，如添加各种

30、植物生长调节物质（BA、ZT、KT、2IP、2,4-D、NAA、IAA、IBA、GA等）以及其他的复杂有机附加物，包括有些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取物、麦芽膏等。61 培养基的营养及成分第53页/共136页第五十三页，编辑于星期五：二点 二十九分。（2 2）无机盐）无机盐无机盐是植物生长发育所必需的化学元素。在植物组织培养时，各种营养物质主要从培养基中获得，如氧、氢元素从水中得到，矿质元素要靠加入适宜的无机盐类物质提供。培养基中除了氧、氢、碳有机物外，剩下的为矿质元素，包括N、P、K、S、Ca、Mg等大量元素和Fe、Mn、Zn、Cu、B、Mo等微量元素。 （

31、1 1）水）水第54页/共136页第五十四页，编辑于星期五：二点 二十九分。 大量元素大量元素 大量元素常占植物体干重的百分之几至万分之几 氮是最重要的。一般用硝态氮或氨态氮硝态氮或氨态氮。即无机氮在培养基中有两种供应形式，一种是硝酸盐；另一种是氨盐。当作为唯一的氮源时，硝酸盐的作用要比氨盐好得多，但在单独使用硝酸盐时，培养基的pH值会向碱性方向漂移。若在硝酸盐中加入少量氨盐，则会阻止这种漂移。因此，培养基既含有硝酸盐又含有氨盐为好。 磷对植物的生命活动具有十分重要的作用，缺磷时蛋白质合成降低。钾、钙、镁、硫等元素能影响植物组织中酶的活性，决定着新陈代谢的过程。 微量元素微量元素 主要包括Fe

32、、Mn、Zn、Cu、B、Mo、Co多种微量元素，用量10-510-7mol/L，植物对这些元素的需要量甚微，稍多即会发生外植体变性、酶失活、代谢障碍等毒害。 微量元素对植物组织的生命活动都有重要作用。如硼促进生殖器进生殖器官的发育官的发育, ,影响蛋白质的合成和授粉受精；铜有促进离体根生长的作用；锰与呼吸作用和光合作用有关。锌锌是各种酶的构成要素，增强光合作用效率，参与生长素代谢。第55页/共136页第五十五页，编辑于星期五：二点 二十九分。 FeFe盐盐 对叶绿素的合成与延长生长起重要作用对叶绿素的合成与延长生长起重要作用。铁元素不易被植物直接利用和吸收，通常以硫酸亚铁和Na2-EDTA(螯

33、合剂)配制成螯合物用于培养基中。 早期配方中曾采用过硫酸铁Fe2(SO4)3，后又用氯化铁（FeCl2）代替硫酸铁，但它们都不是理想的铁供应源。 在根培养时，接种后一周，采用氯化铁的培养基的pH值就由4.95.0偏移到5.86.0，根开始表现出缺铁症。与根不同，愈伤组织由于能分泌与铁离子相结合的天然螯合物，可以在一定程度上利用铁盐。第56页/共136页第五十六页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （3 3）有机化合物）有机化合物 主要包括碳源碳源（也是能源）、维生素类、氨基酸及其他有机附加物维生素类、氨基酸及其他有机附加物。 碳源碳源 植物组织在离体之后，由于没有叶绿体或只有发育不好的叶绿体，基

34、本上不能制造需要的碳水化合物，难以依靠自养作用维持其生存，必须在培养基中另外加入碳水化合物，它所需要的碳素是以各种糖各种糖的形式提供于培养基中。 糖除了在培养基提供培养物所需的碳骨架和能源碳骨架和能源外，还可在一定程度上调节培养基的渗透压渗透压。碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最为重要。一般来说，蔗糖是最好的糖源，它具有热易变（heat-liable）的性质，经高压灭菌后，大部分分解为D-葡萄糖、D-果糖，只剩下部分的蔗糖，这更有利于吸收和利用。此外也可以直接利用果糖、葡萄糖、麦芽糖、纤维二糖等。也有利用多糖类的可溶性淀粉和糊精以及果胶的报道。 常用

35、的糖浓度为糖浓度为15%15%。糖的浓度不只是对细胞增殖有作用，同时也是影响细胞分化的因素之一。 第57页/共136页第五十七页，编辑于星期五：二点 二十九分。维生素类维生素类 主要以各种辅酶的形式多项代谢活动，对生长分化有一定的作用。主要以各种辅酶的形式多项代谢活动，对生长分化有一定的作用。完整植株是能够制造维生素的，但是离体组织却不能合成足够的维生素。常用的维生素浓度约0.11.0mg/L之间。其中盐酸硫胺素（维生素B1）是绝对需要的（全面促进植物生长），一般加烟酸（维生素B3）、盐酸吡哆醇（维生素B6）对根的生长好处。维生素热易变性，易在高温下降解，可进行过滤灭菌，添加肌醇能改善培养植物

36、的生长状况，在培养基中加入1.0 mg/L的肌醇就足以影响维生素B1的效应。加泛酸钙（维生素B5）、生物素（维生素H）以及抗坏血酸（维生素C），但它们并不是普遍的限制因子。 氨基酸氨基酸 是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮源，除构成生物大分子（如蛋白质、酶等）的基本组成外，还具有缓冲作用和调节培养物体内平衡的功能，对外植体的芽、根、胚状体的生长、分化有良好的促进作用。 常用的氨基酸有甘氨酸、酰胺类物质（如谷酰胺、天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。 此外还有谷氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、精氨酸以及酪氨酸等。 第58页/共136页第五十八页，编辑于星

37、期五：二点 二十九分。 天然复合物天然复合物 天然复合物的成分比较复杂，大多数含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。 由于其对一些难培养的培养材料有特殊作用，所以在一些试验中还常常应用它。 常用的天然复合物有椰乳（椰乳（CMCM，100-200mL/L100-200mL/L）、玉米胚乳、香）、玉米胚乳、香蕉汁（蕉汁（150-200mL/L150-200mL/L）、马铃薯汁（）、马铃薯汁（100-200mL/L100-200mL/L）、）、 、水解酪、水解酪蛋白蛋白(CH)(CH)、水解乳蛋白（、水解乳蛋白（LHLH）、酵母提取液（）、酵母提取液（YEYE，0.5%0.5%）、麦芽浸）、麦芽浸出物

38、（出物（MEME）、苹果汁）、苹果汁等。 由于它们是天然有机物，其成分往往不一，这些差异将会影响实验的重复性。第59页/共136页第五十九页，编辑于星期五：二点 二十九分。 植物生长调节物质植物生长调节物质 是培养基中不可缺少的关键关键物质，虽然用量少，但对外植体愈伤组织诱导和根芽等器官分化，起着重要和明显的调节作用。影响最显著的植物生长调节物质主要是生长素类和细胞分裂素生长素类和细胞分裂素类物质。 生长素类：生长素类：促进细胞的伸长生长和细胞分裂，促进细胞的伸长生长和细胞分裂，被用于诱导愈伤形成，促进生根。生长素类中的吲哚乙酸（IAA）由于比较容易被氧化容易被氧化而很少使用，常用的是二氯苯氧

39、乙酸（2,4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚-3-丁酸（IBA）。诱导愈伤组织用诱导愈伤组织用2,4-D2,4-D、NAANAA，用量：，用量：0.1-10mg/L0.1-10mg/L细胞分裂素类细胞分裂素类: :可促进植物细胞的分裂和不定芽形成，打破顶端优势形成丛生芽，有利于芽的增殖，常用于继代和增殖培养。 激动素激动素(KT)(KT)、异戊烯基腺嘌呤（、异戊烯基腺嘌呤（2iP2iP）、）、6-6-苄基腺嘌呤（苄基腺嘌呤（BAPBAP）、玉米素（）、玉米素（ZtZt）、）、噻重氮苯基脲（噻重氮苯基脲（TDZTDZ），强弱依次为：），强弱依次为： TDZ Zt 2iP BAP KT TDZ Zt

40、 2iP BAP KT 。 其它类:赤霉素GA3、脱落酸ABA、多效唑PP333第60页/共136页第六十页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （4 4）培养材料的支持物）培养材料的支持物 为使培养材料在培养基上固定和生长，要外加一些支持物。 琼脂（琼脂（agaragar）是使用最为普遍的凝固剂，本身并不提供营养，它是一种高分子的碳水化合物，从海藻中提取，仅溶于95左右的热水，成为溶胶。通常的用量为0.5-1.0%。加的太多，则培养基过硬；用量太少，则培养基太软，培养基酸度大或灭菌时间过长时，培养基也发软。培养基酸度大或灭菌时间过长时，培养基也发软。 琼脂的质量和纯度不仅对培养基的硬度有影响，而

41、且还会影响培养结果， 固体培养基所需要设备简单，使用方便，只须可供调控温度及光照的培养室。但固体培养基只有部分材料表面与培养基接触，不能充分利用培养但固体培养基只有部分材料表面与培养基接触，不能充分利用培养容器中的养分，而且培养物生长过程中，排出的有害物质的积累，而造成容器中的养分，而且培养物生长过程中，排出的有害物质的积累，而造成自我毒害，必须及时转移。自我毒害，必须及时转移。 液体培养基需要转床、摇床之类的设备，通过振荡培养，给培养物提供良好的通气条件，有利于外植体的生长，避免上述固体培养基的缺点。 第61页/共136页第六十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （5 5） 培养基的培养基

42、的pHpH值值 培养基的pH值因培养材料不同而异。大多数园艺植物都要求在pH5.65.8pH5.65.8的条件下进行组织培养。 培养基的pH值的变化会影响到一些离子的溶解度，会使一些溶解度变小的盐类沉淀，影响到植物对各元素的吸收比例，甚至会出现缺素症。 琼脂培养基的pH值还会影响培养基的凝固情况，一般培养基偏酸时偏酸时（低于低于5.05.0），），培养基凝固较差，需要较多的琼脂才能凝固，反之，培养基偏碱时（高于6.0），凝固效果好。经高压灭菌后pH值会稍有下降,一般用1mol/L HCl调低.用1mol/L NaOH调高. （6 6） 其它成分其它成分在培养基中往往因培养目的不同、植物材料不同

43、，而加入一些其它成分。目前较常见的有活性炭，另外还有抗生素物质、抗氧化剂、诱变剂、生长抑制剂等。第62页/共136页第六十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 63 培养基母液的配制 每种培养基往往需要十多种化合物，配制起来很不方便，也很难达到准确和精确，特别是微量元素和植物生长调节物质用量极少，很难准确秤量，为了简便起见，将配方中的药品一次称量供一段时间使用，即配成一些浓缩液，用时稀释，这种浓缩液就是浓缩贮备液（简称母液母液）。 如果采用配制母液的方法，不仅可以解决上述问题，而且还可以减少工作量和便于母液的低温贮藏。 母液浓缩液是根据培养基配方加大若干倍（一般多为10200倍），一般按试剂种

44、类和性质将其分别秤量，分别溶解，分别配制，单独保存或几种混合保存。 几种试剂混合配制时要按一定顺序将各种溶液混合成一定倍数的母液，母液浓度为实际应用时浓度的10200倍，配制培养基时再按比例吸取即可。 这样配制一次母液，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，提高工作效率，也提高试验精度。第63页/共136页第六十三页，编辑于星期五：二点 二十九分。 常用的配制母液的方法是将大量元素分别称量后，分别溶解后配成大量元素母液，微量元素按统一的扩大倍数分别称量和溶解在一起配制成微量元素母液，铁盐、有机物均需单独配制， 在配制母液时应注意防止产生沉淀。药品应采用纯度等级较高的分析在配制母

45、液时应注意防止产生沉淀。药品应采用纯度等级较高的分析纯纯ARAR（二级）或化学纯（三级），以免带入杂质和有害物质对培养材料（二级）或化学纯（三级），以免带入杂质和有害物质对培养材料有不利影响。有不利影响。 配制母液要用纯度较高的蒸馏水或去离子水，药品称量、定容都要准确。 配好后，在容器上贴上标签，注明配制日期、母液倍数和名称。应置于24冰箱中保存，尤其是生长调节物质与有机物更应如此。 基本培养基的四种母液有：大量元素（浓缩基本培养基的四种母液有：大量元素（浓缩2020倍）；微量元素（浓缩倍）；微量元素（浓缩200200倍）；铁盐（浓缩倍）；铁盐（浓缩200200倍）倍）；除蔗糖之外的有机物质（

46、浓缩除蔗糖之外的有机物质（浓缩200200倍）倍）。在制备这四种贮备液时，应使每一种成分分别溶解，然后再把它们彼此混合。现以MS培养基为例进行母液的配制。 （1 1）大量元素母液）大量元素母液 在配制大量元素母液时一定要分别称量，分别溶解，在定容时按表中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入贮液瓶中，贴好标签和标好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 第64页/共136页第六十四页，编辑于星期五：二点 二十九分。 大量元素母液大量元素母液（配1升20倍的母液） 序号 成分 配方用量(mg/L) 称取量（mg） 1 NH4NO3 1650 33000 2 K N O3 1 9 0 0 380

47、00 3 K H2P O4 1 7 0 3400 4 MgSO47H2O 370 7400 5 CaCl22H2O 440 8800 配配1升培养基吸取量升培养基吸取量50mL第65页/共136页第六十五页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （2 2）微量元素母液）微量元素母液 在配制微量元素母液时也应分别称量和分别溶解，可用蒸馏水，也可用去离子水，定容时不分先后次序，可随意加入容量瓶中定容，一般不会出现沉淀现象。倒入贮液瓶中，贴好标签和标好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。第66页/共136页第六十六页，编辑于星期五：二点 二十九分。 微量元素母液微量元素母液（配1升200倍的母液） 成分

48、配方用量(mg/L) 称取量 （mg） MnSO44H2O 22.3 4460 ZnSO47H2O 8.6 1720 H3BO3 6.2 1240 KI 0.83 166 Na2MoO42H2O 0.25 50 CoCl26H2O 0.025 5 CuSO45H2O 0.025 5 配配1升培养基吸取量升培养基吸取量5(mL)第67页/共136页第六十七页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （3）铁盐母液）铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有其螯合物才容易被植物吸收和利用，因此需要单独配成螯合物母液。目前常用的铁盐为硫酸亚铁（FeSO4.7H2O）和乙二胺四乙酸二钠的螯合物。此螯

49、合物使用方便，又比较稳定，不易产生沉淀。配制方法为：称取5.57克硫酸亚铁和7.45克乙二胺四乙酸二钠，分别用450mL的离子水（或蒸馏水）溶解，分别适当加热并不停搅拌，待分别溶解后，再将两种溶液混合在一起，调整pH值到5.5，最后加蒸馏水或去离子水定容于1000mL的容量瓶中，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和标好记录后放入冰箱内保存。第68页/共136页第六十八页，编辑于星期五：二点 二十九分。 铁盐母液铁盐母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 称取量（mg） FeSO47H2O 27.8 5560 Na2-EDTA 37.3 7460 配配1升培养基吸取量升培养基吸取量5(

50、mL)第69页/共136页第六十九页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （4）有机物母液）有机物母液 按表中用量分别称取各种有机物，分别溶解后，用蒸馏水或去离子水定容于1000 mL的容量瓶中，放入细口瓶中备用，贴好标签和标好记录后置于冰箱中低温保存。琼脂、蔗糖等用量较大的有机物质，不琼脂、蔗糖等用量较大的有机物质，不用配成母液，在配制培养基时按量直接称取，随取随用。用配成母液，在配制培养基时按量直接称取，随取随用。 第70页/共136页第七十页，编辑于星期五：二点 二十九分。 有机物母液有机物母液（配1升200倍的母液） 成分 配方用量(mg/L) 称取量（mg） 肌醇 100.0 20 00

51、0 烟酸（VB5） 0.5 100 烟酸硫胺素（VB1） 0.1 20 盐酸吡哆醇（VB6） 0.5 100 甘氨酸 2.0 400 配配1升培养基吸取量升培养基吸取量5 (mL)第71页/共136页第七十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （5）生长调节物质母液）生长调节物质母液 绝大多数生长调节物质不溶于水，可以加热并不断搅拌促使溶解，必要时加入稀酸或稀碱等物质促溶。各类植物生长调节物质的用量极微，通常使用的浓度单位是mg/L，一般也要配制成母液，母液配制成1mg/mL的浓度，即称取100mg生长调节物质，溶解后用容量瓶定容至100mL。有些药品配制母液时不溶于水，需要用稀酸、稀碱或酒精

52、溶解。常用的生长调节物质和有机物的溶解方法如下：第72页/共136页第七十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （A） 生长素类生长素类 溶于95%的乙醇或0.1mol/L的NaOH中，用去离子水或蒸馏水定容，贮于棕色液瓶中，贴好标签后放入冰箱内低温保存。NAA（萘乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IAA（吲哚乙酸）、2,4-D（苯氧乙酸）般多用少量95%乙醇溶解，然后加热的蒸馏水定容。 （B） 细胞分裂素类细胞分裂素类 溶于0.5或1mol/L的HCL或浓度小的NaOH中，然后用去离子水或蒸馏水定容，贮于棕色液瓶中，贴好标签后放入冰箱内低温保存。KT（激动素）、BA（6-苄基嘌呤）可先用少量1N盐

53、酸溶解，然后加热的蒸馏水定容。 ZT（玉米素） 先用少量95%乙醇溶解，再用热的蒸馏水定容。 （C） 赤霉素类赤霉素类 赤霉素易溶于冷水，但溶于水后不稳定，易分解，最好用95%的乙醇配成母液存于冰箱。用时用去离子水或蒸馏水稀释到需要的浓度。 （6 6）其他）其他（A A）三十烷醇）三十烷醇 取0.1g溶于5mL二氯甲烷中，再加入10mL吐温80，搅拌至溶解后加蒸馏水至100mL，继续高速搅拌至乳白色，即成0.1%乳液，存于冰箱中备用。若储存时间过长发生乳析现象，应先猛烈震荡再使用。 （B B）叶酸）叶酸 叶酸需先用少量氨水溶解，用去离子水或蒸馏水定容。第73页/共136页第七十三页，编辑于星期

54、五：二点 二十九分。 贮备母液都应贮存于适当的玻璃瓶中，分别贴上标签，标注母液名称、配制倍数、日期及配制一升培养基时应取的量母液名称、配制倍数、日期及配制一升培养基时应取的量，母液最好放置于冰箱中低温（24）保存，特别是生长调节物质与有机物类物质，贮存时间不要太长。 在贮备椰子汁（液体胚乳）的时候，要先把从果实中采集到的汁液加热煮沸加热煮沸，以除去其中的蛋白质，过滤，然后置塑料瓶中贮存于-20的低温冰箱内。在使用这些贮备液之前必须轻轻摇动瓶子，如果发现沉淀悬浮物或微生物污染，必须重新配制。 应当注意的是某些生长调节物质如生长素、玉米素、脱落酸、赤霉生长调节物质如生长素、玉米素、脱落酸、赤霉素等

55、以及某些维生素遇热不稳定，不能和其他营养物质一起高温灭菌，素等以及某些维生素遇热不稳定，不能和其他营养物质一起高温灭菌，而要进行过滤灭菌。而要进行过滤灭菌。 每次配制培养基时，吸取母液量（mL）=所配培养基的毫升数/母液浓度倍数。如果配制1000mL培养基，并且母液浓度倍数为200倍，则吸取母液量（mL）=1000mL/200倍=5mL第74页/共136页第七十四页，编辑于星期五：二点 二十九分。 培养基无机营养研究规律： 成分 配方(mg/L) 分子量 摩尔浓度 N H4N O3 1 6 5 0 8 0 20mmol K N O3 1 9 0 0 1 0 1 19mmol K H2P O4

56、1 7 0 2 3 6 1.25mmol MgSO47H2O 370 247 1.5mmol CaCl22H2O 440 147 3mmol F e S O47 H2O 2 7 . 8 2 7 8 0.1mmol N a2- E D T A 3 7 . 3 3 7 2 0.1mmol第75页/共136页第七十五页，编辑于星期五：二点 二十九分。 成分 配方(mg/L) 分子量 摩尔浓度 MnSO44H2O 22.3 223 0.1mM ZnSO47H2O 8.6 288 0.03mM H3B O3 6 . 2 6 2 0.1mM KI 0.83 166 0.005mM N a2M o O4 2

57、 H2O 0 . 2 5 2 4 2 0.001mM C o C l26 H2O 0 . 0 2 5 2 5 0 0.0001mM CuSO45H2O 0.025 238 0.0001mM第76页/共136页第七十六页，编辑于星期五：二点 二十九分。第77页/共136页第七十七页，编辑于星期五：二点 二十九分。 64 培养基的配制 （1）培养基配制步骤 配好各种母液后，就可以准备配制培养基了。配制培养基时可按如下步骤进行，如图。第78页/共136页第七十八页，编辑于星期五：二点 二十九分。 大量 微量 铁盐 有机物 生长调节剂 蔗糖 琼脂 加水混合 调节pH值（用1N HCl或1N NaOH）

58、 加热溶解 玻璃器皿水洗、干燥 分装第79页/共136页第七十九页，编辑于星期五：二点 二十九分。 封口 高压蒸汽灭菌 培养基冷却凝固 培养基存放 准备接种第80页/共136页第八十页，编辑于星期五：二点 二十九分。 （C） 培养基的分装 将调整好pH值的琼脂培养基要趁热分装到培养容器中，琼脂在大约40时凝固。一般每瓶约40mL左右，塞上棉塞或用封口膜等封瓶口材料封口，再用线绳或橡皮筋捆扎。及时做好标记。第81页/共136页第八十一页，编辑于星期五：二点 二十九分。七 外植体 （1）外植体种类从理认上讲，植物细胞多具有全能性，若条件适宜，都能再生成完整植株，任何组织或器官多能作为外植体。但实际

59、上，植物种类不同，同一植物不同器官、同一器官不同生理状态，对外界诱导反应的能力及再生能力是不同的。 A、植物基因型 草本比木本易于组织培养，双子叶植物比单子叶植物易于培养。 B、外植体来源 从田间或温室中生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官或组织作为外植体，离体培养易于成功。对于大多数植物来说，茎尖是较好的外植体，由于茎尖形态已基本建成，生长速度快，遗传稳定，也是获得无病毒苗的重要途径。也可以用叶片、茎段、根等。 C、外植体大小 外植体大小应根据培养目的而定，如是胚胎或脱毒培养，易小。如进行快繁易大。但过大不易灭菌，过小难以成活。一般在0.5-1.0cm为宜。叶片、花瓣5mm2，茎约0

60、.5mm，茎尖分生组织带一两个叶原基0.2-0.3mm第82页/共136页第八十二页，编辑于星期五：二点 二十九分。 (2)植物材料的表面灭菌 A A 外植体的灭菌方法外植体的灭菌方法 植物生长在大自然中，而在大自然中无时无刻不存在各种微生物，处处都有杂菌滋生，因此，从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。采来用于培养的植物材料，不能直接进行培养，必须经过仔细的表面灭菌处理后，获得无菌材料后才能进行培养。把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上，即接种，接种的植物材料叫做外植体。实践表明，外植体材料来源于不同环境条件下，其带菌程度不同，灭菌难易程度和灭菌效果有明显差别，采自田