骨髓微转移检查方法与临床应用价值

1、骨髓微转移检查及临床评价摘要：如何确定实体瘤患者是否具有转移倾向，一直是临床上普遍关心的问题，而骨髓在肿瘤 转移的过程中发挥重要作用，无论易发生还是罕见骨转移的肿瘤患者，骨髓中癌细胞的检出率 均较高，该理论为骨髓微转移检查提供了依据，且多年来的研究表明骨髓微转移检查在预后、 分期、指导治疗及疗效监测方面越来越显示出临床应用价值，因此本文就骨艇微转移的概念、 检查方法及临床应用价值作一综述，并对下一步的研究方向提出了展望。关键词：骨髓；微转移；临床评价；肿瘤detection of micrometastasis in bone marrow and its clinical evaluatio

2、nabsractl it is always interested that how to judge the the disseminative possibility of patients with solid tumors.bone marrow play an important role in the duration of tumor metastasis the presence of individual tumor cells in bone marrow can be detected by immunologic or molecular methods and is

3、being regarded increasingly as a clinically relevant prognostic factor. the early detection of micrometastases could identify the patients at high risk of metastasis who are most (and least) likely to benefit from adjuvant therapy. this review examines the methods used, results obtained and the clin

4、ical significance of studies in this field.key words: bone marrow; micrometastases ; clinical evaluation ; tumor实体瘤患者在接受根治性切除术后，无任何转移征像，在今后若干年内仍有很 高的机率发生远处器官转移。如何在远处器官转移z前，或者在常规影像淫检查发 现z前，尽早确定这部分转移高危患者。有针对性地进行治疗，一直是一个普遍性 的临床问题。研究表明骨髓(bone marrow,bm)在肿瘤转移过程中发挥重要作用， 肿瘤在发生及生长的早期阶段即可转移至bm, bm是肿瘤细胞向靶器官转移

5、的屮 继站、第二器官(secodary organ)汽 在易发生骨转移(如乳腺癌等)和罕见骨转 移(如大肠癌)患者的骨髓屮癌细胞的检出率均可高达30%-50%o该理论为骨髓微 转移(bone marrow micrometastasis,bmm)检杳用丁发现远处器官转移的高危患者 提供了理论依据，本文就bmm的概念、检查方法及临床应用价值作一综述，并对 下一步的研究方向提出了展望。1 bmm的基本概念微转移(micrometastasis)是指常'规病理学方法不能检出的非血液系统肿瘤的转 移。bmm则是在bm中检出了癌细胞，而患者无任何临床和远处器官或bm转移 的证据。bmm和骨传移是

6、两个不同的概念，患者发生bmm并不意味着一定会出 现临床上的骨转移。2 bmm的检查方法2.1常规细胞学检查在无骨转移临床症状的患者，常规细胞学检查阳性率甚低。虽然多点bm穿刺 活检是检测bmm的有效方法，但对微转移灶的检测价值仍很冇限，其最高阳性率 仅为3.6%。2.2 免疫组织化学(immunohistochemistry, ihc)技术ihc法是利用抗原抗体反应的原理，对组织的细胞或其他组织成分进行定位的 一种方法，定位后染色可鉴别单个的细胞。bm属间叶组织，针对肿瘤细胞表面非 间叶组织来源的抗原进行ihc染色，一旦bm成分屮出现染色阳性的细胞，再结合 阳性细胞所具备的恶性特征，则很容易

7、作出bmm的诊断。如乳腺癌为上皮性肿瘤, 具有上皮性来源的细胞生物学特征，而bm本身无上皮性抗原的表达，故应选择针 对上皮性抗原(如细胞角蛋白ck,膜上皮抗原ema,表皮糖蛋白epg等) 的单克隆抗体(moab)进行ihc染色。目前认为ihc法是检测早期肿瘤细胞转移的一种敏感的标准方法，冇报道在2 x 1()6bm单核细胞中有95%的机会检出1个癌细胞。目前该法已广泛应用于乳腺、 结肠、胃、食管、朕腺、前列腺、肾、头颈部、支气管、和肺等组织的恶性肿瘤微 转移研究。利用ihc技术检测bmm虽然其阳性率大大提高但也有一定局限性， 如某些正常bm细胞，淋巴上皮细胞可能会出现不同程度交叉反应，以及肿瘤

8、细胞 表而抗原表达的不均一性，均可影响对转移细胞的正确判断。故实际应用屮，应尽 量选用两种以上的不同的moab (针对细胞膜和细胞质的抗原尤佳)，对染色阳性细 胞进一步观察具形态特征，最后方口j诊断bmmo2.3 逆转录聚合酶链反应 (reverse-transcriptise polymerase chain reaction ,rt一pcr)技术该法是对某一特定基因有表达的组织抽提总rna,经逆转录反应合成cdna, 然后以基因的特异性外显子序列为引物进行pcr,扩增的cdna片段经凝胶电泳分 离。因rt-pcr是对某一组织特定基因在mrna水平的表达检测，故其检测肿瘤隐 匿性微小转移灶，

9、无论是敏感性还是特异性方面均优于其它方法。与ihc染色相比, 既经济又相对简单，月敏感性可增加10j00倍。冇报道，rt-pcr方法可在 心淋 巴细胞中找到3个黑色瘤细胞,5)；能在1()6淋巴细胞中找到1个mcf-7细胞能在 l(f正常细胞中找到1个成神经细胞瘤细胞；能在1()6淋巴细胞中找到1个乳腺癌 细胞。rt-pcr方法检测bm中转移细胞的关键依赖于某种基因的特开性表达，即这 种基因仅在肿瘤细胞(亦可出现于某些正常组织)表达，i佃在bm及血细胞屮不表 达，如酪氨酸酶(tyrosinase)是生成黑色素的关键酶，酪氨酸酶基因在黑色素细胞 中特异性表达，已用于bm和外周血中恶性黑色索瘤的检

10、测，以及乳腺癌患者bm 屮ck-19的mrna的表达。rt-pcr联合southern杂交技术能进一步提高微转移的 检出率。值得注意的是有报道利用巢式(nested) pcr进行两步扩增，结果在正常 淋巴细胞屮也发现ck-19表达，说明正常非上皮细胞亦可能冇内源性ck-19mrna 模板的极低水平表达。故一味追求敬感性会导致特异性的降低，而以40轮pcr扩 增联合southern杂交为宜【。2.4 bm穿刺穿刺点可选择胸骨、双侧骼前上悄等单部位或多部位，多部位的穿刺阳性检出 率高于单部位。一般抽取510毫升bm,经ficoll-hypoque液离心分层,吸取淋巴 细胞层洗涤后涂片，针对相应特异

11、性抗原进行染色，检测bmmo3 bmm的临床应用价值3.1乳腺癌bm是乳腺癌转移最常见的部位之一可发生于临床各期病例。为证实bm中检 出的癌细胞具冇生物淫活性，sharp等(1999)将乳腺癌患者bm +分离出来的癌 细胞于体外培养，结杲其可形成克隆，接种裸鼠亦可形成肿瘤。提示bmm对预测 复发、转移可能具有重要意义，且pantel1121等已证实25-43%的乳腺癌患者存在 bmmobarans等(2001) ihc法检测150例淋巴结(ln)阴性乳腺癌患者的bm和 1590个ln中的ck+细胞。结果示44例（29%） bm中找到cic细胞，仅有13例 （19%）的ln找到ck+细胞，4年无

12、病生存期及总生存率均与bm中找到ck*细 胞相关（p=0.032）而与11微转移无关（p=0.014）,多变量分析证实在ln阴性的 乳腺癌患者，bmm是一个独立的预后因素，ln阴性不一定代表预后良好，实际上 腋窝ln组织学检查只取小块标本，小的肿瘤病灶易被遗漏，若能以ihc法检测腋 窝ln微转移灶，从而确定高危病例是很重耍的，对已有bmm的患者可作为手术后 化疗的一个指征。csuka等（2000）对744例浸润性导管癌,117例浸润性小叶癌，124例复 发的乳腺癌患者进行bmm检查，以rt-pcr法测定ck-20的表达；用westen blot 测定her2、cadherin e（钙粘蛋白e）

13、、cyclin d（细胞周期蛋白d）、bcl2和bax的表 达；用pcr-sscp法测定p53、apc和catenin（链蛋白）基因的表达。结果显示可检 测到30%的ck-20阳性表达；复发性乳腺癌患者的cyclin d、her2和bcl2的水平 增加了 4倍,浸润性导管癌的转移伴随着高机率p53突变（24%）和apc突变（18%）； 浸润性小叶癌的p53突变仅为3%, h cadherin e的水平也很低，而0 -catenin的水 平则较高，因此bmm不仅可指导治疗，月.通过对her2水平和p53突变的测定冇 助与于鉴别高危患者，apc突变可预测浸润性导管癌的进展，而p -catenin突

14、变则 预示浸润性小叶癌的进展。3.2肺癌sugio等（2002）用ihc法以抗ck-18单抗检测58例已行根治切除术的 nsclc患者的bm, ck+细胞的检出率为27/58, cadherin e和b-catenin的低表达 分别为 16 例（27%）和（22 例（37.9%）在 26 例 cadherin e 和/0 -catenin 低表达 的病例中16例找到ck*细胞，32例cadherin e和卩-catenin表达正常的病例中找到 11例ck+细胞，因此作者认为bmm是一个很有意义的不良预后因素，cadherin e 和/或b -catenin低表达对于单个肿瘤细胞是否有转移的可能

15、，具有重要决定意义。passlick等心（2000）对139例nsclc患者行bmm检查，屮位随访66个月 （48-74）,其中ck-18阳性细胞的检出率为59.7%,多变量分析显示:ck-18阳性 的患者危险性比ck-18阴性者人2.8倍，且6例ck-18阳性患者中的4例术后11-44 个月出现复发，而ck-18阴性者无一例复发，因此作者认为ln阴性的患者bmm 是一个独立的预后因素，它有助于检出需系统辅助治疗的患者。术后bm中持续存 在或再现的肿瘤细胞不仅仅是少量的细胞，而是代表真止的骨髓微转移。3.3胃癌schlimok等(1991)用抗ck单抗检测97例胃癌患者的bm,其中34例 bm

16、中找到ck+细胞，口找到ck+细胞的患者复发率明现高于阴性者，他认为bm 屮检测到ck+细胞就可以认为冇单个肿瘤细胞体内传移，具冇独立的预后意义。然而山川等胶(1999)认为临床上消化道肿瘤bm转移少见，检测腹腔中游 离的肿瘤细胞意义更大。胃癌、结肠癌及胰腺癌常发生腹腔的复发和转移，腹腔中 出现游离的肿瘤细胞表明患者的预后差，腹腔屮出现游离的肿瘤细胞与肉眼可见的 腹腔转移同样重要。kakeji等(2002)用ihc法检测106例早期胃癌患者的bm屮ck、血管内 皮因了 (vegf)表达和肿瘤内血管密度。结杲ck+细胞检出率为22例(20.8%), 且ck+细胞的检岀与肿瘤浸润深度、腹膜播散相关

17、,ck+细胞的vegf高表达(73%), 肿瘤内血管密度明显高于ck阴性组，提示bm屮的ck检测有助于鉴别转移高危 人群，预防性的淋巴结清扫辅助化疗和抗血管生成治疗对bmm的病人也许是很重 耍的。3.4大肠癌lindemann等如(1992)报告88例结直肠癌患者bmm的检出率为32%,阴性者 生存期明显高于阳性者(p=0.0084),作者认为即使临床分期和分化程度相同的病人 bmm阳性者预后更差。juhl等(1995)报道147例结直肠癌患者bmm的检出率为40%, bmm阳 性者2年生存期明显低于对照组。li等qi (2000)应用pcr-sscp/银染技术研究51例人肠癌患者bm中p53

18、和 kms基因的突变情况,基因突变阳性者19例(37.25%),阳性检出率与duke's分 期及淋巴结转移显著相关，术后经23个疗程化疗后，19例基因突变阳性者中11 例转阴。捉示大肠癌患者bmm的基因检测血路转移的早期判断，对判断肿瘤恶性 程度和患者预后并指导术后辅助治疗方案的选择有重要意义。3.5胰腺癌thorban等旳(1999)检测48例病理证实为胰腺癌患者的bm,取ck2、kl1 和a45-b/b3等抗角蛋口单抗作ihc分析检测bm上皮细胞，用碱性磷酸酶抗碱性 磷酸酶（apaap）法观察抗体结合，染色者为阳性细胞，并取33例无肿瘤患者的 bm细胞作对照，阳性细胞检出率为52.

19、1% （25例），4例见成簇阳性细胞。刖|瘤复 发与ihc预查的结果相关，40%角蛋白阳性病人发生肝腹膜或骨远处转移；46.7% 有局部复发、而角蛋口阴性病人均未发牛局部复发和远处转移。单因素分析提示存 在bm角蛋白阳性细胞者的生存期降低（pvo.03）。而瑞士学者zraggen等回1 （2001）运用一些特异的ihc技术，检测105例胰 腺癌患者和66例对照者bm与血液标本中的胰腺癌细胞，分析肿瘤分期与患者生 存期的关系。虽然血液肿瘤细胞阳性率与肿瘤分期有关，且后者与患者的生存期显 著相关（pvo.ool）,但是血液和/或bm中发现肿瘤细胞并不与胰腺癌病人的生存期 独立相关。bm屮的肿瘤细胞

20、可能来源于血液，是肿瘤进展的结果，i佃不是原因。 3.6前列腺癌albers等qi （2000）为证实用ck-18/前列腺特异性抗原（psa）检测前列腺癌 患者bm的可靠性，以ihc法和rt-pcr的方法检测34例前列腺癌患者的bm,结 果psa*染色的为12%, ck-18+检出率为17%,阳性检出率与前列腺癌分期或分级 无关，月.假阳性较多，故认为ihc法和rt-pcr法在检测前列腺癌bmm时不可靠, 不推荐作为临床分期的方法。黄瑜峰等1绚（2001）于术前采集前列腺癌59例的bm标本并收集相关资料， 应用ihc方法进行检测ck,并将结果与tnm g分期（级）进行相关分析。结果 bm中ck

21、+细胞检出率为25.4%；除g3/4组阳性率（45.5%）明显高于g©组（12.5%, p=0.01）夕卜，其余各组间的阳性率、差异均无显著性意义。故作者认为ihc法可作 为检测骨髓中隐蔽的微转移肿瘤细胞的一种墩感的标准方法，肿瘤细胞的分化程度 可能与其离开原发灶发生播散的能力有关，该指标是一个独立的危险因索，对预后 评估和治疗方法的选择与确定有指导意义。3.7鼻咽癌chen等勿（1999）运用eber1原位杂交法检测42例鼻咽癌的bm,其屮第一 组32人为常规分期检查，第二组为10例为不明原因的血细胞减少、幼红细胞增多、 dic以及广泛骨转移的患者，结果显示第一组和第二组的阳性检出

22、率分别为3%和 70%,因此作者认为eber1原位杂交法bm检查不推荐作为常规临床分期的方法， 但可以应用于不明原因骨髓转移患者。3.8黑色素瘤fodstad等宙(2001)用免疫磁珠法检测81例黑色索瘤患者bm和血液，结果 发现bm和血液屮的阳性检出率分别为14%和2/81,阳性率在原发灶切除后与总生 存期显著相关(p=0.0001),且经冋归分析证实微转移阳性是一个独立的不良预后指 标，而免疫磁珠法因莫简便、快捷及高敏感性势必在临床广泛应用。4小结与展望诸多文献表明虽然对bmm检查仍存在争议，但其在预后、分期、指导治疗、 疗效监测方面越来越显示出临床应用价值，常规细胞学检查阳性率低，易有假

23、阴性; rt-pcr技术敏感性高，易有假阳性；ihc法相对可靠，但在实际应用中要具体分 析。口前认为，肿瘤细胞合成、分泌大量的基质降解酶，降解细胞外基质，是肿瘤 侵袭转移的分子基础。研究亦证实肿瘤侵袭转移与基质降解酶水平冇关。然而单个 肿瘤细胞在体液屮播散后能否发展成为临床转移，其影响因素尚未明了，认为可能 主要与肿瘤细胞生长的微环境有关，如激素环境、氧化作用、营养物质、生长因子 及血管生成环境等，辅助治疗(化疗、生物治疗)如能在微转移发展成为临床转移 z前根治微转移的肿瘤细胞。则被认为是最理想的根治效杲。因此进一步寻找更为 敏感的检测微转移的方法。探讨微转移的生物学机制，提高对微转移的诊断和

24、治疗 水平，将成为肿瘤学界的一个热门研究方向。参考文献pantel k, cote rj, fodstad o detection and clinical importance of micrometastatic disease. j natl cancer inst, 1999, 91(13):1113-1124braun s, pantel k. biological characteristics of micrometaxtatic cancer cells in bonemarrow. cancer metastasis rev, 1999, 18:75-90diel ij, k

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