实验二蛋白质等电点及含量测定ppt课件

1、1实验二实验二 蛋白质等电点及含量测定蛋白质等电点及含量测定n1台可见光分光光度计配套台可见光分光光度计配套4个玻璃比色杯，用完个玻璃比色杯，用完务必立刻洗净、晾干。切忌用试管刷或粗糙布务必立刻洗净、晾干。切忌用试管刷或粗糙布(纸纸)擦拭。擦拭。n实验终了后，务必将运用过的玻璃器皿洗净、晾实验终了后，务必将运用过的玻璃器皿洗净、晾干、放回原处。干、放回原处。P40/P512n学习蛋白质的两性解离性质，掌握学习蛋白质的两性解离性质，掌握pH值法测定蛋值法测定蛋白质等电点的普通原理和操作方法。白质等电点的普通原理和操作方法。n学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和操学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓

2、度的原理和操作方法。作方法。蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定4n蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：5n蛋白质分子所带净电荷为零时的蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等值称为蛋白质的等电点电点pI。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极挪动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉任何一极挪动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向添加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、浸的倾向添加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、浸透压均减到最低，且溶液变混浊。透压均减到最低，且溶液变混浊。n牛乳中的酪蛋白的等电点

3、是牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7-4.8。本实验采用蛋白质。本实验采用蛋白质在不同在不同pH溶液中构成的混浊度来确定，即混浊度最大溶液中构成的混浊度来确定，即混浊度最大时的时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。值即为该种蛋白质的等电点值。6n 实验仪器实验仪器n 4支支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪200uL、枪头、枪头200uL等。等。n 实验资料和试剂实验资料和试剂n 蒸馏水、蒸馏水、1M醋酸、醋酸、0.1M醋酸、醋酸、0.01M醋酸、酪蛋醋酸、酪蛋白溶液。白溶液。7n每小组取每小组取4支支15mL玻璃试管，按下表顺序分别准确地玻璃试管，按下表顺序分

4、别准确地参与各试剂，参与后立刻混匀，加一管，摇匀一管。参与各试剂，参与后立刻混匀，加一管，摇匀一管。管号管号H2O/mL0.01M HAC/mL0.1MHAC/mL1M HAC/mLpH酪蛋白溶酪蛋白溶液液/mL观察现象（观察现象（min）0 10 20 18.400.6-5.91 28.7-0.3-5.31 38.00-1.00-4.71 47.407.40-1.603.51 n静置，察看各管在不同时间的混浊度。最混浊的一管静置，察看各管在不同时间的混浊度。最混浊的一管pH即为即为酪蛋白的等电点。察看时可用酪蛋白的等电点。察看时可用+，+，+，表示浑浊度。，表示浑浊度。8n察看各管中清澈度变

5、化，记录结果察看各管中清澈度变化，记录结果 用用+，+，+，表示浑浊度并解释景象。表示浑浊度并解释景象。n确定酪蛋白的等电点。确定酪蛋白的等电点。n蛋白质在等电点沉淀的缘由是什么？影响该实蛋白质在等电点沉淀的缘由是什么？影响该实验结果准确性的要素有哪些？验结果准确性的要素有哪些？蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定双缩脲法测定蛋白质含量11n双缩脲双缩脲NH3CONHCONH3是两分子尿素经是两分子尿素经180左右加热，放出左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。个分子氨后得到的产物。n在强碱性溶液中，双缩脲能与在强碱性溶液中，双缩脲能与Cu 构成紫红色络构成紫红色络合物，称为双缩脲反响。合物，称为

6、双缩脲反响。n凡具有两个酰胺基或两个直接衔接的肽键，或能凡具有两个酰胺基或两个直接衔接的肽键，或能过过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反响。蛋白质含有多个肽键，可发生双缩双缩脲反响。蛋白质含有多个肽键，可发生双缩脲反响。脲反响。2+12n紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，颜色深浅而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，颜色深浅可在可在540 nm比色测定，故可用此法来测定蛋白质比色测定，故可用此法来测定蛋白质含量。测定的蛋白质浓度范围为含量。测定的蛋白质浓度范围为1

7、-10 mg/mL。n此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要缺陷是灵敏度深浅相近，以及干扰物质少。主要缺陷是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需求快速，但并不需求差。因此双缩脲法常用于需求快速，但并不需求非常准确的蛋白质测定。非常准确的蛋白质测定。13n 实验仪器实验仪器n 6支支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪200uL、枪头枪头200uL、可见光分光光度计等。绘制规范曲线、可见光分光光度计等。绘制规范曲线n 2支支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪玻璃试管、移液管、吸耳球、移

8、液枪200uL、枪头枪头200uL、可见光分光光度计等。样品测定、可见光分光光度计等。样品测定n 实验资料和试剂实验资料和试剂n 双缩脲试剂、规范牛血清蛋白、蒸馏水、待测样品可以双缩脲试剂、规范牛血清蛋白、蒸馏水、待测样品可以用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白。用酪蛋白溶液，也可用牛乳中提取的酪蛋白。14n1.规范曲线的绘制。全班绘制规范曲线的绘制。全班绘制1份即可份即可n取取6支支15mL试管，编号试管，编号0-5，按下表顺序参与各试剂。，按下表顺序参与各试剂。试剂试剂/mL/mL试管试管0 01 12 23 34 45 5标准牛血清白标准牛血清白蛋白蛋白0.00.00.40.40.80

9、.81.21.21.61.62.02.0蒸馏水蒸馏水2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40.00.0双缩脲试剂双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质含量蛋白质含量 mg/mLmg/mL0.00.02.02.04.04.06.06.08.08.010.010.015 上述试剂加完后，充分混匀，室温放置上述试剂加完后，充分混匀，室温放置30 min。 以以0号管为对看管，于号管为对看管，于540 nm处比色测定吸光值，记处比色测定吸光值，记下各管吸光度。下各管吸光度。 以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，以每管蛋白

10、质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，作吸光度作吸光度-蛋白质含量规范曲线。见电脑桌面蛋白质含量规范曲线。见电脑桌面Excel表格表格“规范曲线绘制规范曲线绘制16n2.蛋白质样品测定蛋白质样品测定 每小组做每小组做1份份n 1.另取另取2支试管，分别加支试管，分别加1 mL未知浓度的酪蛋白蛋白未知浓度的酪蛋白蛋白质样品液留意样品浓度不要超越质样品液留意样品浓度不要超越10 mg/mL，加，加1 mL蒸馏水，加蒸馏水，加4 mL双缩脲试剂，混匀，室温放置双缩脲试剂，混匀，室温放置30 min。n 2.2支样品溶液于支样品溶液于540nm处比色测定吸光值。处比色测定吸光值。n 3. 取两组样品测定

11、的吸光值平均值，根据回归方程计取两组样品测定的吸光值平均值，根据回归方程计算出相应蛋白质的算出相应蛋白质的 浓度。浓度。n 4.按以下公式计算出样品蛋白质的含量：按以下公式计算出样品蛋白质的含量：样品蛋白质含量样品蛋白质含量mg/100 mL=YN100/V 式中，式中，Y为规范曲线查得的蛋白质的量为规范曲线查得的蛋白质的量mg，N为稀释倍数，为稀释倍数，V为样品所取的体积为样品所取的体积mL。y = 0.042x - 0.000417样品蛋白质含量样品蛋白质含量mg/100 mL=YN100/V2.计算样品蛋白质的含量计算样品蛋白质的含量 式中，式中，Y为规范曲线查得的蛋白质的量为规范曲线查得的蛋白质的量mg，N为稀释为稀释倍数，倍数，V为样品所取的体积为样品所取的体积mL。1.绘制蛋白质规范曲线绘制蛋白质规范曲线18n影响规范曲线的要素有哪些？影响规范曲线的要素有哪些？n蛋白质含量测定中需求留意什么问题？蛋白质含量测定中需求留意什么问题？19n等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和参与量必等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和参与量必需非常准确。需非常准确。n规范曲线选择不能只看规范曲线选择不能只看R ，还应该看曲线斜率和截，还应该看曲线斜率和截距。距。R 大小与实验操作和仪器都有关系。大小与实验操作和仪器都有关系。 n显色时间过长，能够会出现雾状沉淀，影响比色。显色时间过