自由基损伤学说及抗氧化剂

1、广东药学院广东药学院药理系药理系自由基损伤学说及抗氧化剂自由基损伤学说及抗氧化剂周四桂周四桂1 铁器在空气中暴露日久铁器在空气中暴露日久会会生锈，洁白生锈，洁白的银器也会由于氧化变黑。人的机体与的银器也会由于氧化变黑。人的机体与金属一样也会受到氧化而导致金属一样也会受到氧化而导致“生锈生锈”，罪魁就是自由基。罪魁就是自由基。2 1956 年英国分子生物学家年英国分子生物学家harman 首次提出首次提出： “氧化应激决定寿命氧化应激决定寿命”，即自由基衰老学说，即自由基衰老学说， 认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。认为衰老是自由基引起的组织随机毒害的结果。 harman, d. j.

2、gerontol. 1956; 11: 298-300 氧氧化化应应激是由于激是由于氧氧自由基自由基过过量生成和量生成和( (或或) )细细胞胞内内抗抗氧氧化防御系化防御系统统受受损损, ,导导致致氧氧自由基自由基及其相及其相关关代代谢产谢产物物过过量聚集量聚集, , 从从而而对细对细胞胞产产生多生多种种毒性作用的病理毒性作用的病理状态状态。3生成生成增加增加，消除，消除减少减少physiol rev. 2002; 82: 4795.4 free radical biology & medicine (if=5.423) free radical res (if=2.878) anti

3、oxid redox signal (if=8.456) redox report (if=1.732)journals of impact factor5impact factor distributions if10.0 = 102 journals (1.6%)elite if5.0 = 228 journals (3.6%)excellent if3.0 = 597 journals (9.3%)very good if2.0 = 869 journals (13.5%)good if1.0 = 2,020 journals (31.5%)fair if1.0 = 2,601 jour

4、nals (40.5%)poorfrom a total of 6,417 sci indexed journals as of march, 20086自由基的概念自由基的概念7自由基自由基（free radicals） 是指外层电子轨道带有一个或多个是指外层电子轨道带有一个或多个未成未成对电子对电子的分子、原子、离子或者基团。的分子、原子、离子或者基团。8活性氧活性氧（ros） 是指分子氧在还原过程中的一系列中间是指分子氧在还原过程中的一系列中间产物。产物。 活性氧包括活性氧包括以自由基形式存在以自由基形式存在和和不以自不以自由基形式存在由基形式存在的具有高活性的中间产物。的具有高活性的中

5、间产物。o2- h2o2 ohsod cat 活性氧自由基活性氧自由基活性氧自由基活性氧自由基gpx9常见自由基的常见自由基的理化性质理化性质10常见自由基常见自由基活性氧活性氧 （reactive oxygen species, ros）活性氮活性氮（reactive nitrogen species，rns） 以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基以碳、氧、氮或硫原子为中心的自由基 11 活活 性性 氧氧（ros）o2- h2o2 ohsod cat no. + o2- onoo- 活活 性性 氮（氮（rns）过氧亚硝基阴离子过氧亚硝基阴离子12超氧阴离子超氧阴离子 (o2-)化学性质化学性质

6、：o2-在细胞内可直接导致在细胞内可直接导致dna损伤损伤，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和，并可使过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生肌酸激酶失活，其细胞毒性作用主要通过衍生产生产生h2o2和和oh。 清除清除：细胞内有：细胞内有sod起清除作用起清除作用。 13过氧化氢过氧化氢 (h2o2)化学性质化学性质：h2o2的性质较稳定，半衰期最长的性质较稳定，半衰期最长，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要，可以穿透大部分细胞膜，因而可以发挥重要的信使功能，但这一特性也增加了其细胞毒作的信使功能，但这一特性也增加了其细胞毒作用。用。 清除清除：h2o2

7、在体内可经过氧化氢酶作用降解在体内可经过氧化氢酶作用降解为水和氧气。为水和氧气。“长效长效”“”“稳定稳定”14羟自由基羟自由基 (oh)化学性质化学性质：oh是已知活性是已知活性最强的氧化剂最强的氧化剂，化，化学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分学性质极为活泼，几乎可以与所有细胞成分发生反应，对机体危害极大。但是由于其作发生反应，对机体危害极大。但是由于其作用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。用范围小，仅能与它的邻近的分子反应。清除清除：主要通过抗坏血酸、：主要通过抗坏血酸、gsh（或其他的（或其他的硫醇）、褪黑色素、硫醇）、褪黑色素、nadph等活性物质及细等活性物质及细胞色素胞色素p4

8、50体系降解和清除。体系降解和清除。“寿命短寿命短”“”“稳定差稳定差”15过氧亚硝基过氧亚硝基阴离子（阴离子（onoo-）化学性质化学性质：onoo-作为一种强氧化剂，作为一种强氧化剂，可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化，可以介导蛋白巯基和非蛋白巯基的氧化，并可氧化细胞膜脂、蛋白及并可氧化细胞膜脂、蛋白及dna，导致细，导致细胞损伤和疾病的发生或介导信号转导。胞损伤和疾病的发生或介导信号转导。降解降解：在碱性条件下，：在碱性条件下，onoo-比较稳定比较稳定。一旦质子化，立即分解产生类羟基和。一旦质子化，立即分解产生类羟基和no2自由基。自由基。1617机体对自由基的防御机体对自由基的防御1

9、819氧化应激与心血管疾病氧化应激与心血管疾病20 在生理情况下活性氧可在生理情况下活性氧可维持在极低水平维持在极低水平，参与机体参与机体生长发育的调控生长发育的调控，信号转导信号转导、诱导、诱导增增殖与分化殖与分化、诱导、诱导凋亡凋亡，调节运动等多种生理过，调节运动等多种生理过程，在生物体内发挥着重要的功能。程，在生物体内发挥着重要的功能。 生成生成增加增加，消除，消除减少减少机体损伤机体损伤 21动脉粥样硬化动脉粥样硬化 是动脉硬化性血管病中最常见的一种。是动脉硬化性血管病中最常见的一种。 动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样。动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样。 引起管壁增厚变硬、失去弹性和管

10、腔缩小。引起管壁增厚变硬、失去弹性和管腔缩小。2223氧化应激与动脉粥样硬化氧化应激与动脉粥样硬化atvb. 2005;25:29-38.24at1 receptorangiithrombinpdgftnf-nadph oxidase acitvityo2.-nadph氧化酶与动脉粥样硬化氧化酶与动脉粥样硬化at1 receptor antagnoistlack of p47phox25氧化应激与高血压氧化应激与高血压26自由基的信号转导途径自由基的信号转导途径27氧自由基参与信号转导通路氧自由基参与信号转导通路 egf receptor protein tyrosine phosphatas

11、es insulin receptor kinase activity cytoplasmic protein kinases mapk cascades protein kinase c isoforms cytosolic ca2+ concentrations transcription factor 28role of ros in egf receptor-mediated signalling29mapk信号级联反应stimulusgrowth factors, mitogen, gpcrp38 mapkstress, gpcr, inflammatory cytokines, g

12、rowth factorsstress, growth factors, mitogen, gpcrmekk1, 4, mlk3, ask1mekk2, 3, tpl2mlk3, tak, dlkraf, mos, tpl2mkk3/6mek1/2mkk4/7mek5erk1/2mapkkkgrowth, differentiation, developmentinflammation, apoptosis, growth, differentiationgrowth, differentiation, developmenterk5/bmk1jnk1,2,3mapkkmapkbiologic

13、al responses自由基的检测自由基的检测31化学发光法化学发光法检测原理：检测原理：活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释活性氧、氧自由基与发光增效剂反应，释放能量，产生化学发光。放能量，产生化学发光。检测对象：检测对象：超氧阴离子、羟自由基、超氧阴离子、羟自由基、h2o2 和脂质过氧和脂质过氧化产生的自由基都可以产生化学发光。化产生的自由基都可以产生化学发光。优点：优点：灵敏、快速、操作简单、价格低廉。灵敏、快速、操作简单、价格低廉。 缺点：缺点：非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯非特异性。另外，几乎所有的氧化剂，如次氯酸、高锰酸钾等都可以与发光增效剂反应，产生化学酸、高锰酸钾等

14、都可以与发光增效剂反应，产生化学发光，严重干扰活性氧的检测。发光，严重干扰活性氧的检测。fe2+也可以产生非常也可以产生非常强的化学发光。强的化学发光。32二氢乙啶二氢乙啶(dihydroethidium, dhe) 检测原理检测原理：可自由透过活细胞膜进入细胞内，：可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；并被细胞内的超氧阴离子氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体氧化乙啶可掺入染色体dna中，中，产生红色荧光产生红色荧光。用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的快速简便的组织组织或或培养活细胞培养活细胞中

15、中ros经典检测经典检测方法。方法。33circulation. 2008;117:1045-1054.determination of ros by dhe staining34检测原理：在碱性条件下，光泽精与检测原理：在碱性条件下，光泽精与超氧阴超氧阴离子离子等过氧化物作用形成激发态等过氧化物作用形成激发态n2甲基吖啶甲基吖啶(n2methylacridan) 。并发出。并发出450nm的激发的激发光，测量此激发光的强度即可定量产生的光，测量此激发光的强度即可定量产生的超超氧阴离子氧阴离子的浓度。可以定量，但的浓度。可以定量，但检测时间长检测时间长，并需要并需要新鲜新鲜组织组织样本样本。l

16、ucigenin (光泽精光泽精)-enhanced chemiluminescence35determination of ros by lucigenin-enhanced chemiluminescence36检测原理检测原理：dcfh-da本身没有荧光，可以自由本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成酶水解生成dcfh。而。而dcfh不能通透细胞膜，不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活活性氧性氧可以氧化无荧光的可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的生成

17、有荧光的dcf，检测检测dcf的荧光就可以得到细胞内活性氧的水的荧光就可以得到细胞内活性氧的水平。平。2, 7-二氢二氯荧光黄双乙酸钠二氢二氯荧光黄双乙酸钠(dcfh-da)37br j pharmacol. 2008;154(1):105-13. determination of ros by dcfh-da staining38394041影响自由基的药物影响自由基的药物43影响自由基的药物影响自由基的药物一一抗抗氧化药物氧化药物二二促促氧化药物氧化药物“以毒攻毒以毒攻毒”44抗氧化药物抗氧化药物 维生素类及内源性物质维生素类及内源性物质，如维生素，如维生素e、维生素、维生素c、维、维生素

18、生素a、gsh等；等； 活性氧防御酶类活性氧防御酶类，如，如sod、过氧化氢酶、过氧化物、过氧化氢酶、过氧化物酶、酶、co-q类等；类等； 化合物化合物，如，如sod模拟化合物、普罗布考以及一些传模拟化合物、普罗布考以及一些传统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素统药物如硫酸锌、甘露醇、钙拮抗药、血管紧张素转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、转化酶抑制药、肼肽嗪、乙酰半胱氨酸、2受体激受体激动药及阻断药等；动药及阻断药等； 中药及其有效成分中药及其有效成分，如银杏、丹参、云芝及其所含，如银杏、丹参、云芝及其所含的黄酮类、酚类、多糖类等的黄酮类、酚类、多糖类等.4546 化学性化学性直接产生自由基及活性氧；直接产生自由基及活性氧； 通过作用于机体防御机制通过作用于机体防御机制，促进机体内自，促进机体内自由基