《生物化学教学》第十一章 核酸的生物合成ppt课件

1、 第 十 章核 酸 的 生 物 合 成第一节 DNA的生物合成 一 DNA的半保管复制 1953年，Watson与Crick共同提出了DNA双螺旋模型，并就其复制过程进展了推测： DNA在其复制过程中，碱基之间的氢键要断裂，双链要解旋分开； 每条单链各自作为模板，在其上合成新的互补链，从而产生两条新的DNA双链，它们坚持了原DNA链上的碱基顺序。 因此，DNA的复制过程就是一个半保管复制的过程。 1958年，Meselson与Stahl利用N的同位素标记，首先证明了DNA的复制过程确实就是一个半保留复制的过程。 他们先使大肠杆菌长期在以15NH4CL为独一氮源的培育基中生长，使其DNA全部变成

2、15NDNA。然后再将细菌转入普通培育基含14NH4CL中，并将各代的细菌DNA抽提出来进展氯化铯密度梯度离心。半保管复制 在DNA的复制过程中，在酶的催化作用下，碱基之间的氢键要断裂，双链要解旋分开； 按照碱基配对原那么，以四种脱氧核糖核苷三磷酸为底物，每条DNA单链各自作为模板，在其上合成新的互补链，从而产生两条新的DNA双链，新的DNA双链坚持了原DNA链上的碱基顺序。参考 DNADNA复制复制 replication replication DNA DNA复制是指以亲代复制是指以亲代DNADNA分子的双分子的双链为模板，按照碱基配对的原那么，合链为模板，按照碱基配对的原那么，合成出与亲

3、代成出与亲代DNADNA分子一样的两个双链分子一样的两个双链DNADNA分子的过程。分子的过程。1半保管复制是双链DNA复制的普遍方式；2即使是单链DNA分子，其复制过程中也要先构成双链的复制型RF;3要求原DNA双链解开，每一单链为模板，依碱基配对原那么，合成另一条互补链。关于“模板的定义 模板：能提供合成一条互补链所需准确信息的核酸链。 有学者提出，模板的定义宜为“用于合成另一种大分子所用的大分子模型； 也有学者提出，模板的定义宜为“能提供合成另一种大分子所需准确信息的大分子模型；4复制、转录及逆转录，在构成双螺旋分子时均需碱基配对；5碱基、核苷、核苷酸单体之间不构成碱基对，而只是在双螺旋

4、时因空间关系而构成。6 DNA半保管复制机制可阐明DNA在代谢上的稳定性。 经许多代复制后，DNA的多核苷酸链仍坚持完好，并于后代不被分解。 DNA较细胞的其它成份要稳定得多。二复制的单位 一复制子 1复制子 复制子指基因组中可以独立进展复制的单位。 每个复制子都含有控制复制的起点，能够还有终止复制的终点。 复制过程是在起始阶段遭到控制的。 一旦复制开场，即进展下去，直到整个复制子完成复制。2复制叉 复制时DNA双链在起点处会构成叉子样的构造，此即复制叉。 随复制叉的挪动，完成DNA的复制过程。 因此，复制叉也被以为是DNA复制的“生长点。 由于DNA复制时会构成复制叉，导致DNA双链在其解链

5、区域看起来象一个泡状构造或象一只眼睛，故有时又将此泡状构造称作“复制泡或“复制眼。3原核生物染色体DNA只需一个复制子 原核生物染色体DNA在其复制时，普通是头一次复制尚未终了，就又在新生链的复制子的起点开场新一轮复制。 E.coli的DNA复制一次需40min。 但在迅速生长的原核生物中，第一次复制尚未完成，第二次复制就在同一个始点上开场，从而，使原核生物可以用更快的速度繁衍。就单个的复制叉的挪动速度而言，就单个的复制叉的挪动速度而言，原核生物的较真核生物的挪动要快原核生物的较真核生物的挪动要快 但由于原核生物染色体DNA只需一个复制子，而真核生物染色体DNA却有多个复制子， 因此真核生物染

6、色体DNA复制的总速度反而比原核生物染色体DNA复制的总速度要快。 在真核生物染色体的不同位置上有多个复制起点，如在30000个碱基对长的果蝇染色体DNA上有20003000个复制起点。 从这些起始点开场向相反方向复制，就构成多个复制泡。 这一情况已用电子显微镜察看得到证明。 4复制子的大小并非绝对不变，这因生物种类而异，也与生长条件、染色体构造等因素有关，且同一DNA分子上不同复制子的大小不均一。二复制的方向 复制的方向可以朝一个或两个方向进展。这是由在复制的起点构成的复制叉的个数决议的： 假设构成一个复制叉，那么复制的方向是一个，这时的复制也就是所谓的“单向复制； 假设构成二个复制叉，那么

7、复制的方向是二个，这时的复制也就是所谓的“双向复制。 复制的多方式复制的多方式 单起点、一方向单起点、一方向多起点、一方向多起点、一方向单起点、双方向单起点、双方向多起点、双方向多起点、双方向 原核生物的染色体与质粒DNA、真核生物的细胞器DNA均为环状的双链分子，它们都在一个固定的起点开场复制，大多数为双向的。 复制普通是对称的，即两条链同时开场复制。 但是，有些那么否，即一条链复制后再进行另一条链的复制。三 原核生物DNA的复制DNA 指点下的DNA合成一DNA的聚合反响 1956年，Kornberg首先从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶，以后在不同的生物中都找到了DNA聚合酶。1. DNA的

8、聚合反响的条件 1 DNA模板； 2 底物dNTP(N=A,G,C,T)； 3 DNA聚合酶及其活性所需求的Mg2+；酶的活性部位严密结合Zn2+； 4与模板DNA互补的一小段多聚核苷酸引物，要显露其3-OH。 引物普通为RNA。但是少数情况是DNA或tRNA。2. 聚合反响 n1dATP+n2dGTP+n3dCTP+n4dTTP+DNA模板 DNA-(n1dAMP-n2dGMP-n3dCMP-n4dTMP)+(n1+n2+n3+n4)PPi3 聚合反响的机理 引物上的3-OH对进入的底物dNTP(N=A,G,C,T)上的 -P进展亲核攻击，构成3，5-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。 所需能量来自

9、 -与 -磷酸基之间的高能键的断裂。 而进入的底物dNTP上的碱基要与模板上相应的碱基配对那么是DNA聚合酶催化反响进展的前提。4 聚合反响的特点 1 只能以dNTP(N=A,G,C,T)为底物，而不能是dNDP或dNMP(N=A、G、C、T)； 2 要有模板的指点，并遵守碱基配对原那么； 3 要有引物及其上的3-OH存在； DNA聚合酶只能催化dNTP加到引物上的3-OH上，而不能使dNTP本身发生聚合。 4 DNA 链的生长方向为53。 5 产物的性质与模板的一样。 以不同来源的DNA为模板，同样引起和促进新的DNA的酶促合成。 产物DNA的性质完全不取决于DNA聚合酶的来源，也与四种脱氧

10、核苷酸的比例无关，而仅仅取决于DNA模板。 产物DNA与模板双螺旋DNA具有一样的碱基组成，也就是说DNA聚合酶能使两条模板DNA链都进展复制。二DNA聚合酶 1 DNA聚合酶 I 大肠杆菌中共有三种DNA聚合酶，这是由Kornberg首先从大肠杆菌中提取的，也是人类发现的第一个DNA聚合酶，也叫Kornberg酶。 1 只需一条多肽链，分子量为109，000，活性部位含有Zn；The search for an enzyme that could synthesize DNA began in 1955. Work by Arthur Kornberg and colleagues led

11、to the purification and characterization of DNA polymerase from E. coli cells, a single-polypeptide enzyme now called DNA polymerase I (Mr 103,000; encoded by the polA gene). Much later, investigators found that E. coli contains at least four other distinct DNA polymerases. 2 是多功能酶，主要具有以下功能。 a 53聚合酶

12、活性 催化DNA 链的合成延伸。 与其它DNA聚合酶一样，只能催化DNA链的延伸，而不能启动DNA链的合成。b 35核酸外切酶活性 此即从3端向5端水解DNA 链的活性。 当酶与模板结合时会引起酶构象的变化，使酶可以正确识别进入的底物核苷酸与模板核苷酸之间的碱基配对与否。 一旦在合成过程中有错误的核苷酸掺入而不能与模板链上的碱基配对时，此酶便可用其35核酸外切酶活性将错误的核苷酸切除而保证正确合成DNA链。 因此，该功能也被以为是“校正功能。该酶的该酶的35外切酶活性只对单链而不是外切酶活性只对单链而不是双链的双链的3-端起作用端起作用 在正常的聚合条件下，该活性遭到抑制，而当碱基配对出现错误

13、时，该酶的聚合反响停顿，而35核酸外切酶活性出现并切除错配的碱基，然后此外切酶活性停顿而恢复酶的聚合酶活性以继续合成DNA链。 可见，在DNA复制的时候，碱基配对受到双重的核对： 聚合酶对碱基的选择作用和35核酸外切酶活性对错配碱基的校正作用。c. 53核酸外切酶活性从5端向3端水解DNA 链而得到核苷酸或寡核苷酸 它只作用于双链DNA中的单链。有时还可以跳过几个核苷酸起作用，如切除紫外照射引起的嘧啶二聚体。 该酶普通在切除引物或修复DNA损伤时起作用。它也被称为修复酶。 有学者提出该酶在DNA成熟过程中起作用。d. 将DNA聚合酶 I 用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶有限水解 可以得到分子量分别为

14、75，000和36，000的两个片段。 大片段具有聚合酶活性与35核酸外切酶活性； 小片段那么具有53核酸外切酶活性。Protease cleavage DNA polymerase I has three enzymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment.DNA聚合酶 II只需一条多肽链，分子量120，000 有53聚合酶活性和35外切酶活性即具有校正功能，但无53外切酶活性。 该酶催化合成D

15、NA的特点与DNA聚合酶I根本一样。需求Mg2+、NH4+的激活。假设要使其催化DNA合成的速度到达最大，那么需求有缺口的双链DNA为模板-引物，且此缺口需约长达50-200bp似应为核苷酸？。此缺口不能过大，否那么酶活性会下降。 该酶也不是复制酶，而是修复酶。3. DNA聚合酶 III 目前以为它是大肠杆菌细胞中真正担任催化DNA 链的合成延伸的酶。具有多个亚基。是多功能酶。 有53聚合酶活性；有35外切酶活性即具有校正功能；无53外切酶活性。 它与DNA聚合酶 II 都最适宜作用于带有小片段缺口小于100bp的双链DNA，而DNA聚合酶I那么最适宜作用在具有大段单链区的双链DNA乃至于带有

16、很短引物的单链DNA。原核生物原核生物DNA-pol DNA-pol DNA-pol 功功能能5 3 聚合活性聚合活性+3 5 外切酶活外切酶活性性+5 3 外切酶活外切酶活性性+-分子量分子量109 000120 000140 000每个菌体中所含每个菌体中所含的酶分子数的酶分子数4004020聚合速率聚合速率（核苷酸数（核苷酸数/分分/酶）酶）100060 000 滞后链合成的模板构成环，复制叉上的二聚滞后链合成的模板构成环，复制叉上的二聚体体DNA聚合酶聚合酶全酶同时合成两条子链。全酶同时合成两条子链。三DNA衔接酶 DNA聚合酶只能催化DNA链的合成延伸，并不能催化DNA 链之间的衔接

17、 催化衔接两条DNA 链的功能由DNA衔接酶来行使。 I. E哺乳动物与噬菌体感染的大肠杆菌+ATP =E-AMP +PPi E 大肠杆菌+ NAD+ = E-AMP + NMNE-AMP + 3ATGT5 5TA-OH P-CA 3AT-GT5= 5TA-OH AMP-P-CA3 III. 3AT GT5 5TA-OH AMP-P-CA3 =3A-T-G-T5 5T-A-C-A3 DNA衔接酶催化DNA双链之切口处的5-磷酸基与3-羟基之间构成3，5-磷酸二酯键。 对切口处的核苷酸残基是什么碱基组成DNA衔接酶并无要求， 而只需求切口处的5-磷酸基与3-羟基该当位于相邻位置。 在反响中要耗费

18、能量，在大肠杆菌中由NAD+提供，而哺乳动物与噬菌体感染的大肠杆菌中那么由ATP提供。 DNA衔接酶不能衔接游离的两条DNA。 T4 DNA衔接酶那么可以作用于上述切口处，而且可以衔接无单链粘性末端的平头双链DNA，但是不能衔接游离的单链DNA。四DNA的半不延续复制 1. 半不延续复制和冈崎片段 1半不延续复制 DNA 双链在其复制过程中，所产生的两条子代DNA 双链里，有一条的互补链是按53方向与复制叉的挪动方向一样连续合成的。 此为前导链又叫先导链； 而另一条的互补链是按53方向与复制叉的挪动方向相反不延续合成的，即先合成假设干短片段，再经酶的作用将这些短片段连起来而构成大片段直到构成完

19、好的互补链。 此为滞后链或随后链。 由于产生的两条子代DNA 双链中的互补链的合成过程从总的来看是一条延续而一条不延续，因此DNA 的复制过程也是一个半不延续复制的过程。 这种景象究其缘由在于DNA聚合酶只能催化合成53DNA新链，而不能催化合成35DNA新链。2 冈崎片段 1968年，冈崎发现DNA 复制时首先合成的是小片段DNA，接着才出现较大的DNA片段，证明DNA 的复制过程是一个半不延续复制的过程。 因此，将DNA 复制时首先合成的小片段命名为冈崎片段。2 冈崎片段和引物RNA合成 冈崎片段的合成不仅需求dNTP(N=A,G,C,T)等底物，还需求一个与模板DNA碱基顺序互补的短片段

20、引物RNA。 1 引物RNA的合成 a. 引发：引物RNA的合成过程。 b. 引发体：引物RNA的合成系统。 c. 引物酶引物合成酶：催化合成引物RNA的酶。为一单链，是引发体的成分之一，只在其中起作用。 d. 冈崎片段合成时，引发体沿滞后链的模板挪动，与复制叉的挪动方向一致，而与冈崎片段合成的方向相反。 挪动到一定位置上即可引发引物RNA的合成。 挪动和引发均需由ATP供应能量。 e. 引物RNA以5-三磷酸结尾。 f. 冈崎片段的合成不需特异的起始部位，由于冈崎片段只具有暂时的功能。 在复制后期，冈崎片段将衔接成DNA大分子。 2 冈崎片段和滞后链的构成 引发体沿模板朝复制叉的挪动方向挪动

21、，断断续续地引发滞后链的引物RNA的合成。 DNA聚合酶 III在引物的3-OH端逐个加上与模板碱基配对的脱氧核苷酸以合成冈崎片段。 再以DNA聚合酶 I 的53核酸外切酶活性逐个去除引物RNA上的核苷酸单位也有学者提出由RNase H来行使此功能，并立刻以前面的冈崎片段为引物，由DNA聚合酶 I 的53聚合酶活性补上与模板碱基配对的脱氧核苷酸单位; 最后，由DNA衔接酶衔接切口而构成完好的互补链。 DNA双链构成双螺旋不需求能量？3 DNA 双链的分别 1 DNA解链酶DNA解螺旋酶 该酶在复制叉的前方解开DNA 双链一小段。 每解开一个碱基对，要耗费两个ATP， 即使2ATP2ADP+2P

22、i 2 单链结合蛋白SSB 它与解开螺旋的DNA 单链结合，可以稳定解开的DNA 单链，并防止复性，维护DNA 单链部分不被核酸酶降解。 它主要结合在A-T碱基对较密集的部位。 有学者提出，SSB能降低天然DNA的熔解温度，促进DNA解链。 原核生物的单链结合蛋白与DNA 单链的结合有正协同效应，即当第一个单链结合蛋白与DNA 单链结合后，后续的单链结合蛋白与DNA 单链的结合那么越加容易。而真核生物的那么否。3DNA旋转酶Gyrase 又称DNA拓朴异构酶2Type II topoisomerase，由两个A亚基105，000和两个B亚基95，000组成。 它兼有内切酶和衔接酶活力，能迅速使

23、DNA链断开又接上。 当ATPADP+Pi供能时，该酶使松驰态的DNA转变为超螺旋态。 无ATP时，又可使超螺旋态DNA转变为松驰态。可协助解链酶使DNA模板解旋。4DNA复制体Replisome 在DNA合成的生长点，即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和辅助因子，在DNA链上构成离散的复合物，彼此配合，进展高度准确的DNA复制。这一构造即为DNA复制体。 DNA复制体只是与复制叉DNA特殊构造相结合的蛋白质复合物。 DNA聚合酶、解链酶、旋转酶、引发体等均为其组成成份。 5复制的终止不需特定信号，也不需特殊的蛋白质参与。关于关于 复复 制制 的的 终终 止参考止参考 大肠杆菌为环形大肠

24、杆菌为环形DNADNA。 复制叉遇到多重拷贝复制叉遇到多重拷贝TerTer20bp20bp后，后，TusTus与与TerTer结合，复制叉停顿前进。结合，复制叉停顿前进。 两个复制叉间的几百个两个复制叉间的几百个DNADNA以一种未知的机以一种未知的机制复制。制复制。 由拓扑异构酶由拓扑异构酶将连环体分开。将连环体分开。四 真核生物DNA的合成 由于真核生物的情况比较复杂，因此总的研讨不如原核生物的详细。 一 DNA聚合酶 现已发现了几种，都需求以dNTP(N=A,G,C,T)为底物，需Mg 2+激活，也需求模板和具有3-OH的引物链，DNA 链的生长方向也为53。 在DNA聚合酶、中，只需D

25、NA聚合酶有35核酸外切酶活性，此外就绝无其它外切酶活性。DNA-pol DNA-pol 延长后随链延长后随链DNA-pol DNA-pol 可能是可能是DNADNA修复修复酶酶DNA-pol DNA-pol 参与参与线粒体线粒体DNADNA复制复制DNA-polDNA-pol 延长前导链延长前导链DNA-pol DNA-pol 校读、修复、填补缺口校读、修复、填补缺口真核生物中真正担任复制造用：真核生物中真正担任复制造用：DNADNA聚合酶聚合酶-， 二 DNA衔接酶 以ATP为能量来源，与大肠杆菌中的作用机制类似。 三 在DNA的合成过程中，也存在冈崎片段，拓扑异构酶、单链结合蛋白等。关于

26、DNA序列的测定酶法 关于DNA测序的测定化学法 化学法测序由Maxam、和Gilbert于1977年所发明。其根本原理是用特异的化学试剂作用于DNA分子中不同碱基，然后用哌啶切断反响碱基的多核苷酸链。用4组不同的特异反响，就可以使末端标志的DNA分子切成不同长度的片段，其末端都是该特异的碱基。经变性胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 4 4组特异的反响如下组特异的反响如下: : (1) G (1) G反响反响 用硫酸二甲酯用硫酸二甲酯(dirnethyl sulfate,DMS)(dirnethyl sulfate,DMS)使鸟嘌呤的使鸟嘌呤的N7N7原子甲基化，加热引起甲基化鸟嘌呤零原子甲基

27、化，加热引起甲基化鸟嘌呤零落，多核苷酸链可在该处断裂。落，多核苷酸链可在该处断裂。 (2) G+A (2) G+A反响反响 用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤环嘌呤环上的上的N N原子质子化，从而使其糖首键变得原子质子化，从而使其糖首键变得不稳定，再用哌啶使键断裂。不稳定，再用哌啶使键断裂。 (3)T+C (3)T+C反响反响 用肼使用肼使T T和和C C的嘧啶环断的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。裂，再用哌啶除去碱基。 (4) C (4) C反响反响 当有盐存在时，只需当有盐存在时，只需C C与与肼反响，并被哌啶除去。肼反响，并被哌啶除去。PCR技术的原理第二节 DNA的损伤与修复 有些物理

28、化学因子，如紫外、电离辐射、化学诱变剂等可使细胞DNA遭到损伤，引起生物的突变或致死。 一 光复活修复 一 紫外照射此起的DNA损伤 紫外照射可使同一单链DNA中相邻的两个嘧啶之间产生一个环形丁烷，因此构成嘧啶二聚体，其中以胸腺嘧啶二聚体TT为主要。 DNA中所含T越多，尤其是陈列中相邻的时机越多，紫外线剂量越大，所构成的TT量越多，这会导致DNA复制和转录功能遭到妨碍，那么细菌对紫外作用越敏感，二 光复活修复 由光复活酶来完成。 光复活酶在暗处即可识别、结合DNA上的受损伤部位嘧啶二聚体，构成酶-DNA复合物。经可见光照射，酶便活化，将二聚体切开，酶再释放，受损部位得以修复。 光复活作用是一

29、种高度专注的修复方光复活作用是一种高度专注的修复方式。它只作用于紫外线引起的式。它只作用于紫外线引起的DNADNA嘧啶二聚嘧啶二聚体。体。 光复活酶在生物界分布很广，从低等光复活酶在生物界分布很广，从低等单细胞生物不断到鸟类都有，而高等的哺单细胞生物不断到鸟类都有，而高等的哺乳类却没有。乳类却没有。 这阐明在生物进化过程中该作用逐渐这阐明在生物进化过程中该作用逐渐被别的修复系统所取代，并丧失了这个酶。被别的修复系统所取代，并丧失了这个酶。二切除修复 不需见光，属DNA损伤的暗复活作用。这是一个暗过程。在一系列酶的作用下，将DNA分子中的受损伤部位切除，以完好的一条链为模板，合成出被切去的部份，

30、再使DNA恢复正常构造。 此过程共分四个步骤： 1由专注的核酸内切酶识别嘧啶二聚体的部位后，在接近二聚体5-端处切断单链DNA，显露3-OH不含二聚体； 2DNA聚合酶以完好的互补链为模板，在断口处进展部分的修复合成； 35-核酸外切酶切去含嘧啶二聚体的寡核苷酸片段； 4衔接酶将新合成的DNA链与原来的DNA链连在一同。 此为“先补后切过程，而“先切后补那么为2和3步互换。 大肠杆菌DNA聚合酶I兼有53核酸外切酶活性，故切除、修复可为同一种酶承当。第三节 细菌的限制聚修饰系统 一细菌的限制性核酸内切酶 细菌体内能识别DNA特定核苷酸顺序的核酸内切酶，即细菌的限制性核酸内切酶。 它是分析DNA

31、的解剖刀，是DNA体外重组的重要工具，是分析宏大DNA分子的重要手段。二细菌的修饰作用 即细菌DNA上的某些碱基，在修饰酶作用下发生改动，此即细菌的修饰作用。这种作用有严厉的种的特异性，从而不被本身的限制核酸内切酶降解。 常见的修饰作用为甲基化作用，主要的修饰酶为甲基化酶。此作用在宿主细胞中往往多次出现，并在整个细胞生活期中坚持完好。三细菌的限制修饰系统 该系统由限制性核酸内切酶和修饰酶组成，它可以降解入侵的异种DNA而不降解本身的DNA，从而可以防止异种DNA侵入本身细胞后的复制与转录，稳定本身的遗传性 .第四节 RNA的生物合成 一原核生物的转录及转录后加工 (一) 转录DNA指点下的RN

32、A合成 即以DNA为模板，在酶的作用下合成RNA的过程。 二 原核生物的转录特点 1 底物NTP(N=A,G,C,U)； 2 RNA聚合酶(RNA polymerase)，纯酶活性基团的有效部分结合有Zn2+； 3 模板DNA； 4 合成方向 在单核苷酸的3-OH上逐个加上与模板碱基配对的核苷酸，与模板的方向相反，朝53方向延伸RNA链。 5 不需求引物。6 转录时的聚合反响 n1ATP+ n2GTP+n3CTP+n4UTP +DNA模板 n1AMP-n2GMP-n3CMP-n4UMP +(n1+n2+n3+n4)PPi + DNA模板7 只以双链DNA中的一条单链作为模板进展转录 其中，可以

33、作为转录模板的DNA单链叫做模板链(template strand )或反意义链(antisense strand)、-链(minus strand)。 而另一条DNA单链那么叫做非模板链(nontemplate strand)或有意义链(sense strand)、+链(plus strand)、编码链(coding strand)。 转录时并非全部DNA都要转录是有选择性的、不对称的。同一染色体上各基因的模板链并不是都在同一条单链DNA上。 8 RNA聚合酶无校正功能。 9 合成的第一个核苷酸经常是GTP(pppG)或ATP(pppA)，其5-三磷酸基在转录过程中坚持完好，不产生PPi。

34、大肠杆菌中以GTP为多。三 RNA聚合酶的组成与功能 1 完好的RNA聚合酶的亚基组成 2全酶； 起始因子； 2中心酶； 不同的细菌中，、 亚基分子量较恒定，而因子分子量变化较大。 从亚基组成方式来看，大肠杆菌中只需一种RNA聚合酶。2 各亚基的功能 1 亚基：与模板的结合、酶的滑动及碱基识别有关。 2亚基：与因子同中心酶的结合有关，并参与RNA合成的引发、延伸，与促进第一个磷酸二酯键的构成有关。 3亚基：参与酶和底物的结合，参与因子与中心酶的结合，此外还结合两个酶必需的Zn原子。 4因子：本身无催化活性，也不能单独与DNA结合，但可识别DNA上的RNA合成的起始信号，在RNA合成中起起动作用

35、。原核生物的原核生物的RANRAN聚合酶聚合酶亚亚 基基分子量分子量功能功能36 51236 512决定那些基因被转录决定那些基因被转录150 618150 618 与转录全过程有关（催化）与转录全过程有关（催化） 155 613155 613结合结合DNADNA模板（开链）模板（开链）70 26370 263辨认起始点辨认起始点5中心酶的功能 单独的中心酶也能催化RNA的合成，但片段长短不一，由于转录的起点不固定，与DNA的结合无序列特异性。 参与因子，那么可使之在特定部位结合。 由于因子可以改动酶与DNA之间的亲和力即静电结合力，酶为碱性蛋白，DNA为酸性分子，使酶与DNA上的特定部位即启

36、动子结合的亲和力加强，使中心酶可以特异结合在DNA上的特定部位即启动子上。 全酶与不同的启动子序列间的结合才干不一样，这导致不同的基因有不同的转录效率。 不同的因子导致RNA聚合酶应为中心酶？识别不同的启动子，从而表达不同的基因。参考 另外，细菌的RNA聚合酶 可有单体=聚合体互变，这与离子强度有较大关系。 在低离子强度下具有可逆的凝聚作用。四 转录的过程 1 启动子与转录因子 1 启动子 指RNA聚合酶识别、结合及开场转录的一段DNA序列。 至少包括三个部位。 a 开场识别部位：RNA聚合酶的识别信号，于-35bp附近。 b 结实结合部位：酶的严密结合点，于-10bp左右，此处A-T碱基对较

37、多，有助于DNA双链部分解开。 c 转录起始点：模板与酶的识别结合模板与酶的识别结合 RNA RNA聚合聚合酶维护区酶维护区 2转录因子 参与RNA聚合酶所进展的转录活动的辅助因子蛋白质。 2 终止子及终止因子、抗终止因子 1终止子 提供转录终止信号的DNA序列。 2终止因子 协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子蛋白质。 3抗终止因子 能阻止终止子的作用，使酶得以越过终止子而继续转录的蛋白质。 RNA聚合酶能越过终止子继续转录，这种景象叫通读 。4终止子的类型 a 不依赖于rho的终止子 它又称简单终止子。 该终止子区域含有一个富含G-C碱基对的回文构造，以该终止子区域为模板转录出来的RNA

38、之3-端有一个polyU，能够提供信号使RNA聚合酶脱离模板，其后即为转录的终点。 可以分析到，在转录的最后阶段，由转录出来的RNA之3-polyU序列与模板之间构成的rU-dA碱基配对极弱，导致该RNA-DNA杂交链在RNA聚合酶于终止子区域暂停时解开。b 依赖于rho的终止子 该终止子区域含有一个不富含G-C碱基对的回文构造，且以该终止子区域为模板转录出来的RNA之3-端无polyU。3 RNA聚合酶催化的转录过程 总的分为起始，延伸和终止三个阶段。 1 起始 RNA聚合酶全酶与DNA上的启动子结合后，DNA双螺旋部分解链。 此时，模板链根据碱基配对原那么与进入的核糖核苷酸互补识别结合。

39、普通将转录时DNA上第一个核苷酸掺入的位置叫作转录起点，以“+1表示。 转录进RNA的第一个核苷酸多为pppA或pppG。 第一个核苷酸掺入后，在DNA 上转录的启动子区域即构成一个启动子-RNA聚合酶全酶-核糖核苷三磷酸复合物，转录正式开场。 当第二个核糖核苷酸与模板结合后，即在RNA聚合酶的催化下与第一个核苷酸反响结合，脱下PPi。此时即生成了新生RNA链上的第一个磷酸二酯键。2 延伸 当在RNA聚合酶作用下生成了RNA中的第一个磷酸二酯键后，因子即分开RNA聚合酶的中心酶，转录的起始阶段即告终了。 这时，因子的分开使中心酶的构象发生变化，以致于中心酶失去了专注性识别、结合DNA特异序列的

40、才干，与模板结合不严密，易于沿模板挪动，并按碱基配对原那么按照模板序列来选择核苷酸合成RNA。 在合成RNA时，中心酶结合的DNA区域双链翻开，呈泡状构造，常称之为转录鼓泡。 新生的RNA链区域会在鼓泡中与模板DNA结合构成RNA-DNA杂交链。 随着转录鼓泡的前进，RNA链不断合成、延伸并被置换出来。 普通讲，在DNA上中心酶覆盖约长达60bp的区域，DNA双链的解链区约长达17bp，而RNA-DNA杂交链约长达12bp。 随着中心酶的挪动，DNA双螺旋在转录方向的前方不断解开，而后面的模板DNA的互补DNA链那么不断取代RNA-DNA杂交链中的RNA链以恢复DNA双螺旋。 实验阐明，大肠肝

41、菌实验阐明，大肠肝菌RNARNA聚合酶以大聚合酶以大约每秒钟约每秒钟50-9050-90个核苷酸的速度合成个核苷酸的速度合成mRNAmRNA。 RNA RNA聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不聚合酶缺乏核酸外切酶活性，不具备核对功能，因此具备核对功能，因此RNARNA转录的准确性比转录的准确性比DNADNA复制误差率约在复制误差率约在10-9-10-1010-9-10-10要求要求低得多，其误差率约在低得多，其误差率约在10-4-10-510-4-10-5范围内。范围内。3 终止 当中心酶沿模板DNA转录到终止子区域时，终止子对中心酶的转录活动产生终止作用。 由于原核生物中的终止子有两种类型，因此终

42、止子的终止作用有不同的特点。a. 简单终止子的转录 其序列特点是在转录终点前有一段序列的模板链富含A，而在这一段的前面又有一段富含GC碱基对的回文序列。 当该终止子区域作为模板进展转录后，所得RNA产物中相应于模板回文序列的区域会发生链内的GC配对而构成较为结实的发夹构造，这个构造足以使中心酶的挪动减慢或暂停RNA的合成； 所得RNA产物内相应于模板链中富含A的区域那么为一段富含U的序列，这段序列与模板链之间的构造较弱，容易导致转录产物RNA脱离模板DNA。b. 依赖于因子的终止子的转录 它虽然也有一段回文序列，但其中并不富含GC碱基对，而且在转录终点前方没有一段富含A的模板链。 该终止子区域

43、作为模板转录出来的产物RNA，虽然也能构成发夹构造，但不结实。 它不象上面以简单终止子区域为模板的转录产物那样有一段富含U的序列，因此它与模板之间的结合不算弱。 这种转录产物虽然可以使中心酶的挪动暂停，但还另外需求因子的协助才干最终终止转录过程。 大肠杆菌的蛋白具有RNA-DNA解螺旋酶活性和依赖于RNA的NTPase活性。它为六聚体，亚基分子量约46KD， 它可以结合在新生的RNA链上，利用其NTPase活性水解NTP获得能量，沿着RNA链向中心酶挪动。 当它与暂停在终止子区域的中心酶结合并相互作用后，那么转录终止，并使RNA-DNA杂交链解链，将产物RNA与中心酶释放。五 转录后加工 原核

44、生物的mRNA不需求加工，转录尚未终了，蛋白质的生物合成就曾经开场，即所谓边转录边翻译。 原核生物的mRNA普通为多顺反子mRNA，即它作为模板时可以编码多条多肽链。 真核生物的那么为单顺反子mRNA，即它作为模板时只能编码一条多肽链。二 真核生物的转录及转录后加工 一 RNA聚合酶 真核生物的RNA聚合酶的性质总的来说与原核生物的类似，但有其特点。 普通根据-鹅膏覃碱对酶的抑制程度而将RNA聚合酶分成以下三种。酶的称号 对-鹅膏覃碱的 分布 催化合成的前体 敏感程度RNA聚合酶IA 不敏感 核仁 rRNA前体RNA聚合酶IIB 敏感 核质 mRNA前体 对低浓度的 hnRNARNA聚合酶IIIC 中度敏感 核质 tRNA前体与 对高浓度的 5SRNA真核生物真核生物RNARNA聚合酶聚合酶Pol