实验绿色荧光蛋白(共11页)

1、 生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：2011506066班级：11级生技02班 前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕

2、中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。 二实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因

3、与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。 本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达3. 实验材料及仪器1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5；BL21；2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、P

4、CR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。四.实验内容4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定：1) 实验试剂：LB培养基；溶液；Tris-HCl（pH=8）；溶液；溶液；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸染色剂；1%的琼脂糖凝胶；Xho(10U/l)；Nde（10U/l）；T4 DNA lisase。2) 实验步骤： 质粒的提取与鉴定（1）在含有质粒的DH5平板菌落上挑取单菌落，接种于20ml含有100l /ml Apm的LB液体培养基中，37、200rpm振荡培养过夜。（2）分装菌液到1

5、.5ml离心管中，冰浴2min。4、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清。再用同样方法收集一次菌体。（3）将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液中，涡旋剧烈振荡 ，混匀，冰浴10min。（4）加200l新鲜配制的溶液，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀，冰浴5min。（5）加入150l预冷的溶液，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管数次，使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10min。4、12000rpm 离心10min。 （6）加等体积的酚/氯仿（1：1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min。4、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心

6、管中。（7）加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混合有机相和水相，4、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中。（8）加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20沉淀DNA 10-20min。4、12000rpm 离心10min，弃上清，留沉淀（管底有少量白色沉淀）。（9）分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀， 12000rpm 离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发。（10）加30l TE（内含浓度50g/ml的RNase A）溶解DNA，37放置30min，消化RNA。-20保存备用。（11）制1%的琼脂糖凝胶：加25ml×TAE缓冲液于

7、三角瓶。称取0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化。冷却至60左右，加1l的GoldView溶液，摇匀。轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上。轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。（12）点样：取5l质粒DNA及2l加样缓冲液混合上样，80100v约电泳2030min。 质粒DNA的酶切（1）酶切：按如下双酶切体系（20l）混合反应物质粒5l3lXho(10U/l)0.5l0.5lNde（10U/l）0.5l0.5l10×buffer2l2lddH2O12l14l 先加水，再加buffe

8、r，加质粒，加内切酶，放离心机上混匀。在37水浴4h。（2）电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切结果。 4.2目的基因的获得和重组载体的构建1) 实验试剂：模板DNA；dNTP；Taq DNA聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+）；ddH2O；10×T4DNA连接酶buffer；T4DNA连接酶。2) 实验步骤： 目的基因的获得、检测及回收（1）依次混匀下列试剂：反应体系ddH2O9.5 lMix12.5 l上游引物1 l下游引物1 l模板1 l混合后瞬时离心。（2）PCR反应程序 94 预变性 3 min 94 变性 30 sec 52 退火 30 sec 30个循

9、环 72 延伸 1 min 72 延伸 1 min 4 （3）电泳：扩增产物用1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。（4）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量。（5）以0.1g 凝胶对应300l 的体积加入PN。（6）50 水浴10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解。（7）将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管中，13000rpm 离心60s，弃掉废液。（8）加入800l漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。（9）加入500l漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液。（10）将离心吸附柱放回收集管，13000r

10、pm离心2min。（11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30l，洗脱缓冲液在65水浴中预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中，13000rpm离心1min。（12）电泳检测回收产物，余置于-20保存。 重组质粒的连接 将PCR扩增的目的基因片段产物与PGM-T载体连接。反应体系（l）如下； 体系成分 体积（l） 溶液 5PGM-T载体 0.2目的基因产物 4.8 将反应液混合，16 30 min。 4.3感受态细胞的制备及转化1) 实验试剂:LB培养液；0.1mol/L CaCl2溶液；E.c

11、oli DH5受体菌（R-M-）；LB培养基；氨苄青霉素；IPTG；X-gal。2) 实验步骤 感受态细胞的制备（1）活化E.coli DH5菌株：将实验室保存的E.coli DH5菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37、200rpm振荡培养过夜。（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37、200rpm振荡继续培养至OD400值为0.3-0.5左右。（3）在已灭菌的10ml离

12、心管总吸取上述培养液10ml，冰浴20min 后，4、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清。（4）加2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重悬菌体，冰浴10min。4、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清。（5）将每一份沉淀轻缓的悬于0.4ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，轻轻重悬菌体沉淀。冰上放置10min。（6）分装100l/管（冰浴分装），置-4冰箱保存。 连接产物转化感受态细胞（1）转化用固体LB培养基平板的制备 向含有100g/ml氨苄青霉素（Amp）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG 16l和20mg/ml的X-gal 40

13、l，用灭菌涂布棒涂布均匀，37避光倒置3 h，让溶解X-gal的二甲基酰胺尽量挥发干净。加入IPTG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。（2）连接产物转化E.coli DH5感受态细胞 去5l连接产物加到100l E.coli DH5感受态细胞（从-70冰箱取出放于冰上，带钢解冻加入连接产物）中，轻弹混匀，冰浴20min。取出离心管，42水浴热击90s，立即置冰浴中冷却3min。向离心管中加入900l 37预热的无抗生素的LB液体培养基，混匀后，37、200rpm振荡培养1 h，复苏菌体。取出离心管，6000rpm离心2min，弃上清800l，用剩余的月100l上清液将沉淀菌

14、体吹打混匀后，加到含100l/ml氨苄青霉素（Amp）的IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀。放在室温直至液体吸收。倒置平板，37恒温培养14-16h，直至长出单菌落。 4.4重组子的筛选鉴定1) 实验试剂：dNTP；Taq聚合酶；引物；10×buffer（内含Mg2+） ；ddH2O ；Nde；Xho；Apm；LB培养基2) 实验步骤 重组质粒的PCR鉴定（1）挑取单菌落：使用无菌枪头挑取5个白色单菌落，放入内含有氨苄抗生素的LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡培养4h以上，吸取0.5l菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。（2）PCR反应体系（

15、10l）ddH2O9.5 lMix12.5 l上游引物1 l下游引物1 l模板1 l 混匀后瞬时离心。（3）PCR反应程序 94 预变性 3 min 94 变性 30 sec 52 退火 30 sec 30个循环 72 延伸 1 min 72 延伸 1 min 4 （4）电泳： 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。 重组质粒的酶切鉴定（1）挑取上述经菌液PCR鉴定为阳性的菌落，接种到20ml含60g/ml Apm 的LB液体培养基中，37、200rpm摇床培养过夜。（2）质粒DNA的提取（碱裂解法），加50-100l TE（内含50l/ml的RNAaseA）溶解DNA，37放置30min，消化R

16、NA。（3）双酶切鉴定体系：用限制性内切核酸酶对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。 酶切体系（20l）体系成分体积质粒5lXho(10U/l)0.5lNde（10U/l）0.5l10×buffer3.0lddH2O11l 4.5目的基因在原核细胞中的表达1) 实验试剂：LB培养基；kan；IPTG。2) 实验步骤 （1）重组质粒的转化：将重组质粒转化表达宿主菌E.coil BL （2）重组质粒的鉴定 （3）重组质粒的诱导表达五.实验结果与分析实验一：质粒DNA的提取和酶切电泳鉴定实验结果：当时实验时，有两个是只加氯仿，还有两个是按实验步骤操作的，结果只有两条明显的条带.如图2所示

17、。有条带的是 1、4管没有条带的是 2、3管实验分析在实验过程中，试剂添加失误或试剂配制不成功。导致未提出纯化DNA。杂质没有去除干净，DNA没有完全提纯加入酚/氯仿没有被异戊醇/氯仿中和完全，导致那两个失败。实验二：目的基因的获得和重组载体的构建实验结果 跑胶结果：与maker比较得 bp DNA 胶重：3g 电泳检测结果：与目的基因大小一致 实验三：大肠杆菌感受态的制备和连接产物转化感受态细胞实验结果：失败，没有筛选出蓝白斑实验分析：在实验过程中，操作不严谨，不够细心小组成员在无菌操作时其他组员在旁边说话，可能谈话的过程中，使溶液或器皿受到污染，导致实验失败在涂板时，没有将溶液均匀地涂开或

18、涂板的时间太短，导致实验失败实验四:重组质粒的酶切和PCR鉴定实验结果：获得重组质粒 操作过程中仪器故障 实验分析：刚开始实验失败，失败的原因是PCR仪在工作时突然停止，导致重组质粒在PCR扩增时没有充分扩增，导致实验失败。图片上最后一个条带有点暗，原因是点滴的体积太少。实验五：目的基因在原核细胞中表达实验结果:可观察到荧光络合物。如图4所示实验分析：归功于小组团员的团结和努力六实验讨论 讨论：重组质粒转化率不高，其原因可能有以下几点：（1）生长时期：实验发现在对数中期的大肠杆菌易生感受态，转化时菌浓度应控制在不超过107个/ml。浓度过高或者过低都会影响转化效率。 （2）CaCl2法0 放置

19、时间的影响：细菌经0 CaCl2处理后转化率随时间的推移而增加，24 h达到最高，之后转化率逐渐下降。 （3）化合物及无机离子的影响：在钙离子的基础上，联合其他二价金属离子或还原剂等物质处理细菌，可使转化率提高100-1000倍。 （4）质粒大小、构型的影响：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。1 ng超螺旋DNA即可使50 ul的感受态细胞达到饱和。一般情况下DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。 （5）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在冰浴低温和无菌条件下进行，

20、所用器皿，如离心管、EP管等均应彻底洗净，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂 DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。 （6）试剂的质量：所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。 （7）42 热处理时间很关键，转移速度要快，且温度要准确，同时注意热处理过程中离心管不要摇动。 （8）菌液涂平皿操作时，应避免反复来回涂，因为感受态细胞的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。心得体会：本实验设计是一个综合性的，与我们平时实验经历相比对我们的要求更多更严。它主要要求我们形成认真思考的习惯，自己查阅本实验的相关文献，分析本实验的目的，通过本实验要达到什么样的结果，达到预计的结果需要通过怎样的方案实现，根据实验需要和自己的相关了解自己设置适合的实验方案，增强我们的思维能力和动手能力，同时也使我们的团队合作精神得到了提高，并学会把我