MS培养基及配制注意事项

1、MS培养基母液的配制母液成分规Ah里浓缩倍数称取量(mg)母液体积(ml)配制1升培养基吸 取量定容编号种类大KNO319001019000量NH4NO31650101650010001元MgSO4- 7H2O370103700100素KH2PO41701017002CaCl2 - 2H2O4401044001000100MnSO4- 4H2O22.31002230ZnSO4- 7H2O8.61008603微H3BO36.2100620量KI0.8310083100010元Na2MoO4 - 7H2O0.2510025素CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.025

2、1002.54铁Na2-EDTA37.31003730100010盐FeSO4.4H2O27.81002780甘氨酸2.01001005有盐酸叱哆醇0.510025机盐酸硫钱素0.1100550010物烟酸0.5100256肌酸100100500050010注意：1.大量元素按照使用时高io倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaC12 2H2O单独配制外，其余化合物混合在 500ml烧杯中加适量蒸储水溶解，用玻璃棒搅 拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸储水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合 物名称(或编号)，浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaC12 2H 2O配制同上置于另

3、一小口瓶中。2.微量元素母液的配制按要求浓缩 100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐(FeSO4 7H2O和Na2-EDTA.2H 2。)作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸储水溶解后，定容在 1000ml 容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。3 .铁盐配制将FeSO4 7H 2O和Na2-EDTA.2H 2O分别溶于450ml蒸储水中，加热，（很重要）不断搅拌， 溶解后， 两液混合， 调 PH 至 5.5 加水定容至1000ml ， 置于小口瓶中， 贴上标签。4 有机物母液配制，按母液要求浓缩50 倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500m

4、l 容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5 母液最好在24 的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。1 制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯） 。2 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（ NAA ） ，吲哚乙酸（ IAA ） ,赤霉素（GA3 ） ， 2，

5、 4-D 等生长素和玉米素（ZT ）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（ KT ）和 6-苄基嘌呤（ BA ）可溶于少量1mol/L 的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。称取 50mg 生长调节物质，溶解后，在 100ml 的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg ，配制后一般要求在低温（04）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为 0.5mg 时，则取 1ml 母液即可。二、培养基配制和灭菌一养培养基配制程序（一 ）.母液吸取量的计算配制培养基的升数公式1:母液吸取量=母液体积（CC） X母液浓缩倍数公式2：母液吸取量培

6、养基要求的含量（各种生长调节剂）母液每 CC 的含量（2） 各种母液按顺序编号排列A. 大 量 元 素 ； B.CaCl2.2H2O ；C. 微 量 元 素 ； D. 铁 盐 ； E. 有 机 物 ；F.生长素蔡乙酸（NAA）:配制0.5mg/ml的NAA称取50mg , NAA用少量95%酒精溶解 后加蒸馏水定容至1000ml； G.细胞分裂素、激动素 （KT ） 配制 0.5mg/ml 的 KT 称 50mgKT用少量1N HCL溶解后，加蒸储水定容至100ml。（3） 配制培养基（ 1000ml ）1. 琼脂 : 称取 57g 琼脂，加入 300ml 蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.2

7、. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取 30g 白糖， 溶于溶有琼脂的 300ml 蒸馏水中。3. 各种母液的吸取（培养基养基 1L）（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（ A）和CaCl2 2H2O母液（B）各100ml（2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（ C）,铁盐（D）母液各10ml（3） 用 10ml 移液管或吸管吸取有机物（ H） 10ml（ 4 ） 移取激素将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80 左右，用酸度计或精密 PH 试纸测定培养基的 PH 一般要求5.86.0，过酸过碱则用1N NaoH 和 1N HCL 调整。二分装：用一个接有胶管的分

8、装器趁热装培养基， 1000ml 培养基分装到 25-30 个三角瓶中，每个三角瓶约 30ml 左右（一般占试管、三角瓶容量1/41/3 左右）注：培养基勿碰瓶壁。三 . 包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。三、高压蒸汽灭菌锅的使用方法具体操作步骤：1. 高压锅放水至平把架；2. 把包扎好的培养基装入高压锅 ;3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽 （注意对角拧紧螺帽 ）关上气阀和安全阀 .4. 然后接通电源.5. 压力计升至0.05MPa 时，打开放气阀 ,排除冷空气（

9、此步很重要）。6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa 位置时，开始计算灭菌时间， 具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa 时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa 时接通电源，不断重复此操作过程，维持20 分钟。7. 灭菌时间达到 20 分钟后， 除去电源， 打开放气阀 （注意要逐渐放气）待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖（注意对角扭松螺帽）稍待冷后再把培养基取出。8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染， 可将培养基置于25 下保存4 天， 如果培养基需要贮存较长时间， 可在4低温下保存。灭菌高压锅有大型卧式、

10、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。进水-放进培养基-盖紧锅盖-关上放汽阀-检查安全阀-接上加热源-待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀0.11MPa（121 C）下灭菌2025分钟，保持稳定压力-除热源-逐渐打开放气阀-锅内空气排除完后-开放锅盖-稍冷后取出培养基。四、无菌操作技术（一） 植物材料表面 消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料， 都不同程度地带有各种微生物。 这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。 因此， 植物材料必须经严格的表面灭菌处理， 再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。1.接种步骤：第一步：清理材料-流

11、水冲洗加入吐温（或洗衣粉）清洗自来水冲洗第二步：对材料的表面浸润灭菌：70%酒精浸10-30秒无菌水第三步：灭菌剂处理-0.1-1%升汞5-8 min （或其他灭菌剂）第四步：无菌水进行冲洗注意事项：1 .灭菌剂一般要临时配制，现配现用.升汞可以短期储存.2 .对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3-4次，升汞一般5 -8次，每次不少于3 min3 .灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底.4 .灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。5 .灭菌液要充分浸没材料2.无菌操作可按以下步骤进行：(1)在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；(2)在接种前

12、20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；(3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；(4)上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；(5)先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镣子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；(6)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镣子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。(如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基)在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。(7)接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌

13、 30分钟，若连续接种，每 5天要大强度灭菌一次。常用植物激素类别名 称缩写词分子量使用浓度范围母液配制说明生 长 素2, 4二氯苯氧乙酸2, 4- D221.00.001 10mg/L生长素通常 用NaOH溶 液滴至溶解 成溶液。能溶于乙醇IAA易被植物 细胞所氧化。 故培养基中很 少单独使用。a 蔡乙酸NAA186.20.001 10mg/L口引噪一3一乙酸IAA175.20.001 -10mg/L口引噪一3一丁酸IBA203.20.001 -10mg/L细 胞 分 裂6苇基氨基喋吟BA225.2分裂素通常 能溶于稀NaOH ,含水 乙醇或稀盐 酸玉米素不耐 热，不能高压 灭菌。6糠基氨基

14、喋吟KT215.2N异戊烯氨基喋吟(玉米素)ZT219.2赤 霉 素赤霉素GA3346.4能溶于乙醇不耐热不能高 压灭菌在愈伤 组织和悬浮培 养物的启动和 保持生长时才 需要有时小植 株再生时也需 要四、常用药品的配置方法1.1mol/L HCl 的配制 ：根据盐酸的密度 37%盐酸溶液的密度为 1.19 克/毫升，假设要配制1000ml 1mol/L HCl ，则需要盐酸的物质的量为 1mol ，所以需要量取37% 的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml2.1mol/L 的 NaOH 的配制 ：称 40gNaOH ，然后融于1000ml 的蒸馏水中。 （定容到 100ml）3.95% 的酒精配制成75% 的酒精： 用量筒量取750ml 的 95%酒精加入 200ml 的蒸馏水即可得到 75% 的酒精。如果用无水酒精配制 75%的酒精，则量取750ml 的无水酒精，再加水250ml 。4.0.1% 的升汞配制： 先称取 1 克升汞粉末，然