生物工程下游技术第三章微生物细胞破碎

1、酶来源应用实例L-天冬酰氨酶Erwinia Carotovora治疗急性淋巴癌过氧化氢酶Aspergillus niger牛奶灭菌后H2O2的清除胆固醇氧化酶Nocardia rhodochrous胆固醇浆液分析半乳糖苷酶Kluyveromyces fragilis在牛奶/乳清中乳糖的水解作用葡萄糖异构酶Bacillus Cogulans高果葡萄糖浆的生产葡萄糖氧化酶Aspergillus niger葡萄糖浆液分析食品中氧的清除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶Yeast临床分析蔗糖酶Saccharomyces Cerevisiae糖果、蜜饯青霉素酰化酶Escherichia Coli苄青霉素的脱酰作用药

2、物名宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素大肠杆菌治疗侏儒症干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤 脂蛋白脂多糖脂质双层细细 胞胞 壁壁特殊组分：特殊组分：外外膜膜h肽聚糖：N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸、半乳糖胺h氨基酸：D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸h磷壁质h糖h脂质G+ 菌肽聚糖结构菌肽聚糖结构:五肽交联桥五肽交联桥 五个甘氨酸五个甘氨酸四肽侧链四肽侧链 L-丙、丙、D-谷、谷、L-赖、赖、D-丙丙聚糖骨架聚糖骨架 G：N-乙酰葡萄胺乙酰葡萄胺 M：N-乙酰胞壁酸乙酰胞壁酸聚糖骨架聚糖骨架： 同G+ 菌四肽侧链四肽侧链： L-丙、D-谷 DAP、D-丙G- 菌

3、肽聚糖结构菌肽聚糖结构:细胞壁细胞壁革兰阳性菌革兰阳性菌革兰阳性菌革兰阳性菌强度强度较坚韧较坚韧较疏松较疏松厚度厚度20-80nm10-15nm肽聚糖层数肽聚糖层数可多达可多达560层层1-2层层肽聚糖含量肽聚糖含量占细胞壁干重占细胞壁干重50%-80%占细胞壁干重占细胞壁干重5%-20%磷壁酸磷壁酸有有无无外膜外膜无无有有细细 胞胞 壁壁项目项目革兰阳性菌革兰阳性菌革兰阴性菌革兰阴性菌细胞壁的关系细胞壁的关系染色性紫色红色细胞壁对酒精的通透性抗原性主要为磷壁酸主要为外膜细胞壁的化学组成不同毒性无内毒素有内毒素内毒素为阴性菌细胞壁成分 脂多糖对青霉素的作用有效无效青霉素作用部位为肽聚糖 五肽交

4、联桥对溶菌酶的作用有效无效溶菌酶作用部位为肽聚糖 聚糖骨架细细 胞胞 壁壁细胞膜细胞膜位于细胞壁内紧包细胞质，结构与真核细胞基本相同。位于细胞壁内紧包细胞质，结构与真核细胞基本相同。功功能能细胞膜电镜照片细胞膜电镜照片分泌呼吸分泌呼吸载体蛋白载体蛋白脂质双层脂质双层细胞膜模式结构图物质转运物质转运生物合成生物合成特殊结构荚荚 膜膜化学组成：化学组成：功能：功能：肺炎链球菌肺炎链球菌Capsule多糖或多肽抗吞噬作用粘附作用抗有害物质损伤作用产汽荚膜杆菌糖及其氨基衍生物氨基酸脂质 细胞声波搅拌液压冷冻压力动物细胞7777G-芽孢杆菌和球菌6566G+芽孢杆菌5（4）54酵母3.5342.5G+球

5、菌3.5(2)325孢子2(1)21菌丝16(1)5一、破碎率的评价 破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分比数，即：%100/ )(%)00NNNY1、直接计数法 平板计数法血球细胞计数器2、间接计数法产物测定法电导法 细胞破碎 机械非机械液体剪切固体剪切超声波：超声波机械搅拌：振动器压力：Chaikoff 挤压机研磨：研棒、研钵、珠磨压力：X-压滤机干燥溶胞物理：渗透冲击化学：阴、阳离子洗涤剂酶：溶菌酶、酶噬菌体溶胞真空干燥 空气干燥 冷冻干燥 溶剂干燥 原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一齐搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的相互

6、剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎作用遵循一级动力学定律：)(RRkdtdRmRm能使放出的蛋白质最大数量(mg/g)R为t时间内释放的蛋白质数量(mg/g)k破碎的比速度 ktxRRRmm11ln)/(lnmRRx/KR)1/(1lnqvV /转盘外缘速度细胞浓度珠粒大小温度流量I延长研磨时间I增加珠体装量I提高搅拌速度I提高操作温度2、液体剪切法（高压匀浆法）、液体剪切法（高压匀浆法） 原理：利用高压使细胞破碎。不宜采用高压匀浆的破碎的微生物细胞：v已造成堵塞的团状或丝状真菌；v较小的革兰氏阳性菌；v含有包含体的基

7、因工程菌 高達20,000PSI(約138MPA)以上的壓縮氣體，可以有效的將細胞膜打破。 可溶蛋白的集聚超过溶解度；可溶蛋白的集聚超过溶解度； 蛋白合成太快，导致分子间疏水相互作用聚合而不溶；蛋白合成太快，导致分子间疏水相互作用聚合而不溶； 高表达的蛋白没有形成正常的二硫键连接；高表达的蛋白没有形成正常的二硫键连接； 蛋白的助溶物缺乏；蛋白的助溶物缺乏； 包含体的形成与蛋白的稳定性有关。包含体的形成与蛋白的稳定性有关。包含体:蛋白相互交联 在一起形成不溶性的聚集物 蛋 白产物占菌体总蛋白/%外源蛋白的积累人胰岛素50%形成包含体-丙酰胺酶20%在细胞区间-人体干扰素25%形成包含体凝乳酶原形

8、成包含体牛生长激素30%形成包含体-内酰胺酶形成区间包含体人胰岛素原6%26%形成包含体R：蛋白质释放量；Rm：蛋白质最大的释放量；p：操作压力；k：速率常数；：与微生物种类有关的常数kNpRRRmmlnZ：常数P：破碎压力P0：临界压力：细胞浓度参数/ )(exp10ZppR超声波引起空穴，在相当高的输入声能超声波引起空穴，在相当高的输入声能下，液体各部分会形成许多小气泡，在声波膨下，液体各部分会形成许多小气泡，在声波膨胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡胀相中，这些气泡会增大，而在压缩相中气泡会被压缩，直到不能在压缩时，气泡破破裂，会被压缩，直到不能在压缩时，气泡破破裂，释放出猛烈的阵

9、。这种震波通过介质传播。在释放出猛烈的阵。这种震波通过介质传播。在气泡发生空穴现象的破碎期间，大量身能转化气泡发生空穴现象的破碎期间，大量身能转化成弹性形式的机械能，引起局部的剪切梯度使成弹性形式的机械能，引起局部的剪切梯度使细胞破碎。细胞破碎。I 蛋白释放常数k取决于输入的声能。) tKexp(R1pP/ )WW(K0p杆菌球菌;革兰氏阴性革兰氏阳性;细菌酵母.振幅；细胞悬浮液的粘度；表面张力；被处理悬浮液的体积；探头的形状和材料；细胞悬浮液的流速；E 需要高的能量并且生产高温和高的剪切力，易使不稳定产品变性失活；E 破碎非专一性；E 碎片尺寸分布广泛。 原理：利用酶分解细胞壁上特殊的化学键

10、使之破壁的一种方法。 优点：产品的选择性高； 抽提的速率和收率高； 产品破坏最少； 对pH和温度等外界条件要求底； 不留细胞残片。 缺点：酶的费用高；通用性差；产物抑制 分类：外加酶法；自溶法生物体酶水解键的类型细菌糖苷酶N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶多肽酶肽聚糖中AGA和AAM之间的（1、4）-键残基；某些糖肽中的N-乙酰胞壁酰基残基和L-氨基酸残基之间的键；甘氨酸-甘氨酸，丙氨酸-甘氨酸等的肽键。真菌、酵母-（1，3）-葡聚糖酶-（1，6）-浦聚糖酶甘露聚糖酶甲壳素酶蛋白酶聚糖中随机（1，3）-键聚糖中随机（1，6）-键（1，2）-或（1，3）-或（1，6）-D甘露糖苷键甲壳糖和壳糊精

11、中的N-乙酰-6-D-氨基葡萄糖基（1，4）-B-键藻类纤维素酶纤维素中的（1，4）-键5、化学法、化学法原理：用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些 组分的方法。优点：对产物有选择性 细胞外形保持完整，碎片少。缺点：通用性差 时间长 有些化学试剂有毒性用于化学法的试剂种类： 酸碱调节 有机溶剂 表面活性剂 EDTA鳌合剂 变性剂细胞类别变性剂清洁剂有机溶剂 酶抗生素生物试剂鳌合物G-菌*G+菌*酵母菌*植物细胞*巨噬细胞*渗透压法反复冻结融化法干燥法X-press法多种破碎方法相结合与上游过程相结合培养过程控制寄主细胞的选择克隆噬菌体溶解基因耐高温产品基因表达与下游过程结合细胞壁：* 提供机械强度给细胞，使其成为一个整体* 由于其伸缩特性，使细胞承受外部环境渗透压的快速变换