可可毛色二孢菌对白木香产生倍半萜诱导作用

1、可可毛色二砲菌对白木香产生倍半菇诱导作用摘要为了明确可可毛色二胞菌lasiodiplodia theobromae对白木香产生倍半菇的诱导作用。采用气质联用 (gc-ms)对可可毛色二胞菌pda发酵液进行检测，发酵液 中检测到茉莉酸类化合物(jasmonates, jas)。利用固相微 萃取-气质联用(spme-gc-ms)检测发酵液处理后白木香愈 伤中沉香倍半菇成分，发现其能够诱导白木香愈伤产生a- 愈创木烯(a-guaiene), §-愈创木烯(§ -guaiene), a - 蛇麻烯(a-humulene) 3种沉香倍半菇。推测可可毛色二胞 菌可产生茉莉酸类物质，其作

2、为伤害信号分子诱导白木香产 生倍半菇。关键词可可毛色二砲菌；茉莉酸类物质；白木香；倍 半菇收稿日期2013-07-16基金项目国家自然科学基金项目( 31000136, 81173481)；北京市自然科学基金项目(6102024)；教育部 新世纪优秀人才支持计划项目(2008)；高等学校博士学科 点专项科研基金项目(20091106120009)； “十二五”国家 科技支撑计划项目(2011bai01b07)；海南省中药现代化专 项项目(2010zy001,2012zy002)；海南省重大科技研发专 项(zdzx20100006)通信作者*张争，tel: (010) 57833363, e-m

3、ail： zhangzheng321126. com； *李秀锦，教授，tel: (0335) 8061569 , e-mail： lixiujin9824aliyun. com作者简介韩晓敏,tel: (010) 57833363, e-mail： hanxiaomini98817sina com白木香 aquilaria sinensis ( lour)gilg 又称土 沉香，属瑞香科沉香属植物，为我国特有的热带及亚热带常 绿乔木，是我国生产名贵芳香类药材沉香的唯一法定植物来 源1。沉香是我国、日本、印度以及其他东南亚国家的传 统名贵药材和名贵的天然香料，其味辛、苦，性微温，能行 气止痛、

4、温中止呕、纳气平喘2。白木香只有受到真菌侵染等伤害才产生沉香。华南植物 研究所从沉香样品中分离到黄绿墨耳菌menanotus flavolives并证实该菌可加速白木香结香进程3-4。本实验室首次分离到白木香枝枯病菌可可毛色二胞菌lasiodiplodia theobromae,并证实其可以诱导白木香 产生沉香倍半菇等物质5,但其机制尚不明确。michiho等 将植物伤害信号分子茉莉酸甲酯(meja)加入至白木香悬浮 细胞中诱导产生了沉香倍半菇a-愈创木烯、a-蛇麻烯和 6-愈创木烯6。有研究报道称可可毛色二砲菌可产生植物 伤害信号分子jas并导致植物程序性死亡7-9 o本实验将 验证分离的可

5、可毛色二胞菌能否产生jas,及其能否诱导白 木香产生上述3种倍半菇，以期深入揭示真菌诱导白木香产 生沉香的机制。1材料可可毛色二砲菌 l. theobromae （ genbank no. jq782210. 1）是本实验室从白木香枝枯病枝中成功分离。乙 酸乙酯（ar,国药集团化学试剂），茉莉酸甲酯（sigma,美 国），三甲基硅烷基重氮甲烷（sigma,美国）。气相色谱仪 alent7890a,气质联用仪 varian450gc-300ms,旋转蒸发 仪（buchi,瑞士），萃取头（supecl, pdms/dvb/car,美国） 及萃取瓶（supecl , 7 ml,美国）。2方法2. 1

6、可可毛色二鞄菌发酵液中jas的萃取及甲酯化将实 验室保存的可可毛色二胞转接到pda培养基，活化培养5 d。 将活化培养基打成菌饼，置于pd培养液中，30 °c, 150 r min-1 黑暗培养 7 d9o 4 °c, 5 000 r min-1 将可可毛 色二胞菌发酵液离心20 min,取上清液用6 mol l-l hc1 调ph至3.0后用等量乙酸乙酯萃取3次，取上层液合并。 将萃取液按400 ： 1减压浓缩。向1 ml浓缩液中于通风橱中 加入10滴三甲基硅烷基重氮甲烷，甲酯化30 min后置于 -20 £冰箱密闭保存，备用。2. 2gc-ms检测茉莉酸甲酯将

7、甲酯化后的jas与茉莉酸甲 酯对照按如下色谱质谱条件进行gc-ms分析。气相色谱条件：石英毛细管柱vf-5ms, 0. 25 mmx60 m, 膜厚0.25 umo升温程序：从50 °c开始以10 °c - min-1 升到 155 °c,保留 15 min；再以 8 °c - min-1 升到 280 °c, 保留10 min。载气为he,柱流量1 ml min-1,进样量1 p lo 进样口温度为250 °c,不分流。质谱条件ei源；电离电压 70 ev；离子源温度250 °c；全扫描范围50500 amu。2. 3甲酯

8、化后茉莉酸甲酯的含量测定茉莉酸甲酯对照品 4. 78 mg,溶于2 ml乙酸乙酯中进行梯度稀释，按上述条件 进样，以浓度为横坐标(x),峰面积为纵坐标(y)绘制标 准曲线。按照相同条件对2. 1项下制备的甲酯化样品进行含 量测定。2. 4spme-gc-ms检测沉香倍半菇按照xu等10方法处理 白木香愈伤，取2.1项下制备的甲酯化样品适量加入少量 dms0,配制成1 mmol lt的水溶液，均匀喷洒于生长良好 的白木香愈伤，黑暗培养24 ho同时用乙酸乙酯和meja处 理样品分别作为阴性对照和阳性对照。收集样品，液氮速冻, 置于-80 £冰箱备用。取诱导处理样品适量，液氮研磨成细粉，

9、转入7 ml顶空瓶中，马上用硅树脂的盖子密 封盖好。用活化好的固相萃取头(pdms/dvb/car, supelco) 在60 °c水浴平衡30 min,顶空萃取30 min。按照陈怀琼等11色谱质谱方法，顶空进样5 min后进行gc-ms分析。对 照样品进行同样操作。3种倍半菇通过检索nist08标准质谱 图库和文献6, 12-13报道综合鉴定。3结果与分析3. 1可可毛色二胞菌发酵液成分分析在甲酯化后的可可 毛色二胞菌发酵液萃取物中共检测到24种化合物。其中含 量较高的主要为乙酸丁酯(2. 16%),琥珀酸二甲酯(9.01%), 茉莉酸甲酯(30.70%),駄酸二丁酯(42.29

10、%),茉莉酸甲酯 作为目标化合物是可可毛色二胞菌发酵液乙酸乙酯部分的 主要成分之一，见表lo表1可可毛色二砲菌发酵液成分分析table 1 chemical composition of the fermentation of lasiodiplodia theobromae3.2可可毛色二胞菌发酵液中茉莉酸甲酯的含量测定样 品中茉莉酸甲酯的定性见图1,茉莉酸甲酯在36 min左右出 峰，其质谱信息见图2。绘制的meja标准曲线为y=0. 000 ix, r = 0. 999 9,线性范围为1.912478 mg - l-lo重复测定 甲酯化后萃取物中茉莉酸甲酯的质量浓度为250. 55 mg

11、 - l-1,含量相对稳定且为主要成分之一。a.对照茉莉酸甲酯总离子流图；b.甲酯化后可可毛色二 胞菌发酵液的总离子流图；1.茉莉酸甲酯。图1可可毛色二胞发酵液的总离子流图fig. itotal ion chromatogram ( tic ) of the fermentation of lasiodiplodia theobromaea.对照茉莉酸甲酯；b.样品中茉莉酸甲酯。图2meja的ms图fig. 2ms spectra of meja3.3可可毛色二胞菌代谢物对沉香倍半菇的诱导作用通 过spme-gc-ms检测可可毛色二砲菌代谢物处理白木香愈伤 的成分中检测到了 3种沉香倍半菇，分

12、别为a-愈创木烯(8. 34%), 6-愈创木烯(1.56%)和 a -蛇麻烯(21.08%)。 该结果与对照茉莉酸甲酯处理白木香愈伤检测到的倍半菇 成分相同，含量相近a-愈创木烯(5. 93%), §-愈创木烯(1.89%)和a-蛇麻烯(26.20%)。与作为阴性对照的乙酸 乙酯处理对比，可可毛色二胞菌代谢物对上述3种倍半菇的 诱导作用很强，是诱导结香的主要原因，如总离子流图所示, 见图3。各倍半菇的结构和质谱信息见图4。a.乙酸乙酯处理；甲酯化后可可毛色二鞄菌发酵液处 理；1. a-愈创木烯；2. a -蛇麻烯；3. §-愈创木烯。图3白木香愈伤总离子流图fig.3to

13、tal ion chromatogram (tic ) of aquilaria senensis callusa, b, c. nist库中a-愈创木烯，a -蛇麻烯和§-愈创 木烯的ms图；a, b, c检测样品中a-愈创木烯，a -蛇麻 烯和§-愈创木烯的ms图。图4a -愈创木烯，a-蛇麻烯和6-愈创木烯的ms图fig.4ms spectra of a-guaiene, a-humulene and 6-guaiene4讨论健康的白木香不产生倍半菇等沉香类物质，只有树体受 到真菌侵染等伤害后才会产生沉香。关于真菌侵染结香，国 内外报道侵染菌主要有黄绿墨耳菌melan

14、otus flavolivens, 色二胞 diplodia sp.,镰胞 fusarium sp.,曲霉 aspergillus sp., 毛霉 mucor sp., 青霉 penicillium sp., 木霉 trichoderma sp.,裂褶菌 schizophyllum sp.等14-18 o 本实验室分离到白木香枯枝菌病原可可毛色二砲l. theobromae并证实该枯枝菌能侵入白木香诱导沉香药材形 成，并成功制备了沉香真菌诱导剂5, 19。但是真菌诱导 白木香结香的机制尚不完全明确。jas是植物和真菌的重要调控因子，能够调节植物的生 长和发育。研究表明jas在生物或非生物胁迫条

15、件下可以激 活植物体内相应的防御基因，使植物产生各种类型的化学防 御物质，包括倍半菇类、单菇类、黄酮类等次生代谢产物 20 o本研究首次证实项目组前期分离的可可毛色二胞菌能 够产生茉莉酸类化合物，甲酯化的发酵产物能够诱导白木香 愈伤产生a-愈创木烯(a -guaiene )、6 -愈创木烯 (a -humulene)和a -蛇麻烯(6 -guaiene) 3种沉香倍半 菇，初步揭示了 jas介导的可可毛色二胞菌诱导白木香产生 沉香倍半菇机制。该研究为深入研究可可毛色二胞诱导白木 香结香机制和研发快速、高效的真菌诱导剂用于生产高品质 沉香提供了基础数据。沉香化学成分复杂，尤其倍半菇类成分种类更多

16、。本课 题组检测利用真菌诱导剂诱导白木香所结沉香中的化学成 分，共检测到倍半菇类物质46种19。本研究中可可毛色 二鞄菌发酵液及茉莉酸甲酯溶液对白木香愈伤的诱导产物 中只检测到了 3种沉香倍半菇a-愈创木烯、6-愈创木烯和 a-蛇麻烯，远未达到优良结香效果。考虑到真菌剂较茉莉 酸类物质作为信号分子成分复杂，诱导白木香树体结香过程 尚不明确机制仍需继续探索，故尚不能用茉莉酸类物质来替 代真菌诱导剂诱导白木香树体结香。参考文献1张争，杨云，魏建和，等白木香结香机制研究进展 及其防御反应诱导结香假说j.中草药，2010, 41 (1)： 156.2中国药典.一部s1.2010.3戚树源，林立东，胡厚

17、才，等白木香中色酮类化合 物的形成j.中草药，2000, 31 (9)： 658.4戚树源，陆碧瑶，朱亮锋，等白木香中白木香醛形 成的研究(简报)j.植物生理学通讯，1992, 28 (5)： 336.5张争，杨云，魏建和，等白木香枝枯病病原菌的鉴 定j中国中药杂志，2013, 38 (11)： 82.6 michiho i, ken-ichiro 0, toru y, et al.induction of sesquiterpenoid production by methyl jasmonate in aquilaria sinensis cell suspension culture j

18、. j essent 0订 res, 2005,17 (2)：175.7 tsukada k, takahashi k, nabeta k bisoynthesisof jasmonic acid in a plant pathogenic fungus lasiodiplodia theobromae j phytochemistry, 2010, 71：2019.8 dhandhukia p c, thakkar v r. separation andquntitation of jasmonic acid using hptlc j j chromatogr sci,2008, 46：3

19、20.9 dhandhukia p c, thakkar v r. standardizationof growth and fermentation critertia of lasiodiplodia theobromae for production of jasmonic acid j aft j biotechnol, 2007,6 (6)：707.10 xu y h , zhang z , wang m x, et al. identification of genes related to agarwood formation： transcriptome analysis of

20、 healthy and wounded tissues aquilaria sinensis j bmc genomics, 2013,14 (1 )：llchen h q, yang y, xue j, et al. comparisonof compositions and antimicrobial activities of essential oils from chemically stimulated agarwood, wild agarwood and healthy trees of aquilaria sinensis (lour. ) gilg j. molecule

21、s, 2011,16： 1.12 0kudera y, ito m. production of agarwood fragrant constituents in aquilaria calli and cell suspension cultures j plant biotech, 2007,26：307.13 kumeta y , ito m characterization of delta-guaiene synthases from cultured cells of aquilaria , responsible for the formation of the sesquit

22、erpenes in agarwood j plant physiol,2010,154(4)： 1998.14 bose s r. thenature of agar formation j scicult, 1934,4 (2)：89.15 bose s r enzymes of wood-rotting fungi jergeb enzymforsch, 1939,8：267.16 subeham, junya u, fujino h, et al. a fieldsurvey of agar-wood in indonesia j j trad med, 2005, 22 (4)：24

23、4.17 gibson ias the role of fungi in the origin of oleoresin deposits ( agaru ) in the wood ofaquillaria agallocha ( roxb)j bano biggynpatrika, 1977,6 (1)：16.18 ng l t, chang y s, azizol l k. a review onagar (gaharu) producing aquilaria species j j trop for products, 1997,2 (2)：272.19 魏建和，张争，杨云，等.一种

24、沉香诱导剂及其制 备方法：中国，zl200910241212. 8p. 2010-06-16.20 zhao j, davis l c, verpoorte r. elicitorsignal transduction leading to production of plant secondary metabolites m biotechnol advance, 2005, 23 (4)：283.21aldridge d c, galt s, g订esd, et al. metabolites of lasiodiplodia theobromae j j chem soc, 1971 (

25、c)： 1623.study of production of sesquiterpenes of aquilaria senensisstimulated by lasiodiplodia theobromaehan xiao-minl, liang liang2, zhang zheng3, 4*, li xiu-jinl*, yang yun4, meng hui4, gao zhi-hui3, xu yan-hong3(1.school of environmental and chemical eng in eer ing, yan sha n university, qinhuan

26、gdao 066004, china；2. shandongtraditionalchinese medicineuniversity， college of pharmacy, ji 7 nan 250012, china；3. instituent of medicinal plant development , chinese academy of medical sciences & pekingunion medical college, beijing 100193, china；4. hainan branch of institute of medicinal plantdevelopment, chinese academy ofmedical sciences & peking union medical college,hainan provincial key laboratory of resourseconservation and developme