猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化及活力测定

1、实验三 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定生物化学与分子生物学 刘志坚 S20141122一、超氧化物歧化酶（SOD）概述SOD是一种酸性蛋白，是唯一以自由基为底物的酶，具有清除自由基的功能酶，在酶分子上共价连接金属辅基，因此它对热、PH以及某些理化性质表现出异常的稳定性。SOD根据所含金属辅基不同可分为三种：第一种是铜（Cu）锌（Zn）金属辅基称（Cu/Zn-SOD）最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于肌体细胞浆中。它为同源二聚体酶，其中一个亚基结合一个Cu原子，另一个亚基结合一个Zn原子，两个亚基间的相互作用提高了酶的催化活性和稳定性，金属原子的氧化还原完成了酶的催化功能。

2、第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（MnSOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。MnSOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn3+处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配位His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（FeSOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。其活性中心是3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成。其中，MnSOD 、FeSOD的结构特征是不含半胱氨酸，含有较多的色氨酸和酪氨酸，因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质，在280nm附近有最大吸收峰，MnSO

3、D的可见光谱在475nm处附近有最大吸收，FeSOD在350nm处有最大吸收，这都反映了所含金属离子的光学性质。SOD为自由基清除剂，它广泛存在于生物体的各种组织中，能清除O2-（超氧阴离子）自由基，而超氧阴离子自由基具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。它的功能为：（1） 抑制心脑血管疾病：机体的衰老与体内氧自由基的产生与积累密切相关，SOD课清除人体内过多的有害的氧自由基，是对健康的有益的功效成分。具有调节血脂的保健作用，可预防动脉粥样硬化，预防高血脂引起的心脑血管疾病。降低脂质过氧化物的含量。（2） 抗衰老：年龄的增长和某些体外因素

4、会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常清除自由基的能力，从而使皮肤组织造成伤害，导致衰老。由于SOD能够清除自由基，因而可以延缓衰老。（3） 防治自身免疫性疾病：SOD对各类自身免疫性疾病都有一定的疗效。如红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎等。（4） 肺气肿：肺气肿患者亦可使用 SOD ，但应在病变初期肺弹性纤维尚未受到损害时使用，疗效较好。 （5） 辐射病及辐射防护：对有可能受到电离辐射的人员，可注射 SOD 作为预防措施。 （6） 老年性白内障： 对这类疾病应在进入老年期前即开始经常服用抗氧化剂，或者说经常注射SOD。一旦形成白内障，则应该摘除，因为此时使用SOD无效。 （7） 抗氧化： 医学报

5、告指出， 抗氧化能力的衰退期已提前至40岁左右，光靠蔬果已经不足以消除人体内外共同形成的氧化压力。 （8） 预防慢性病： 自由基是科学家最近才发现导致各种慢性病与老化的罪魁祸首，故说它是“万病之源”，是人体健康的大敌，自由基对身体的伤害是日积月累的，尤其是糖尿病与心血管方面的疾病。 （9） 抗疲劳： 过多的自由基在体内残存，就犹如毒素蓄积在体内一样，会让人：容易疲劳、厌倦、注意力不集中、常常昏昏沉沉、打哈欠。SOD对上班族熬夜加班、学生应付考试所产生的疲劳，在提振精神及集中注意力方面成效显著，有助于工作绩效的提升，及考试成绩的进步。 二、原理超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧离子自

6、由基（O2-）的金属酶，它具有抗衰老。抗辐射、抗炎抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业等方面具有了广泛的应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、 pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它所含金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫红色；Fe-SOD呈黄褐色。SOD催化下述反应：2H+2O2-H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内的含量的相对平衡。机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传

7、递结果可产生一些O2-。在某些疾病（如氩中毒、辐射病等）过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢（物）酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。本实验采用有机容易沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可用以下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%的酶量定义为一个酶单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮

8、蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈现蓝色。在一定范围内，溶液在595nm波长下的光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，测定范围1-1000g。SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氧化硝基四氮唑蓝（NBT）有黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处应显示为蓝色，而有SOD处应无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱（即同工酶的数量、分布活性大小）。三、实验试剂与器材(略)四、操作步骤1.SOD的提取1取新鲜

9、猪血40ml于50ml离心管，6000r/m，10min离心，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min离心，弃上层清液，再加入2倍体积的0.9%NaCl溶液重复清洗一次，4000r/m，10min离心，得洗净的红血球粘稠液。2向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，匀浆呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min离心，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样1ml。然后将清液在65-70恒温水浴中进行热处理，15min

10、后取出迅速冷却到室温，4000r/m，5min离心除去沉淀，得浅黄色粗酶液，留样1ml。3向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱静置过夜，4000r/min，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积预冷的丙酮溶液清洗两次，离心收集沉淀，自然干燥即得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。2. SOD活力测定 1 邻苯三酚自氧化率的测定取4.5ml 50mmol/L pH8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml 10mmol/L EDTA-Na2溶液，混匀后在25水浴保温20分钟，取出后立即加入25预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/L

11、HCl作空白，325nm波长下每隔30秒钟测光吸收值一次，整个操作在4分钟内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.070/min左右。2 酶活力测定操作与基本一致，加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光吸收值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。3 酶活性单位的计算根据酶活性单位的定义，按下列公式计算酶活性：其中，A0：为邻苯三酚自氧化率；Am：加酶后邻苯三酚自氧化率；总活性(U)单位活性×酶原液总体积4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）：（1） 标准曲线的制作：取6支具塞试管，编号，按下表加入试剂：

12、试剂管号123456 蛋白质标准液(ml)00.20.40.60.81.0 蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20 考马斯亮蓝G-250(ml)555555盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。放置10分钟，在595nm波长下比色测定光吸收值，比色应在1小时内完成。以牛血清白蛋白含量（ug）为横座标，光吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。（2） 样品中蛋白含量的测定将待测的SOD溶解并稀释到一定浓度，取1支试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。（3） 蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光吸收值，在标准曲线上查

13、得相应的蛋白质含量(ug)，计算其浓度。（4） 结果处理利用考马斯亮蓝G-250法测定每毫升酶原液蛋白质毫克数。将测得的数据填入以下表格：提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性(U/ml)总活性(U)比活性U/mg. pr回收率(%)纯化倍数除血蛋白上清热变性后上清丙酮沉淀后的五、结果与分析结果邻苯三酚自氧化率的测定：1 邻苯三酚自氧化速率=（0.094+0.091+0.087+0.084）/4=0.089/min样品/时间(min)0.511.522.533.5410.042 0.076 0.108 0.142 0.176 0.207 0.237 0.268 20.034 0.072

14、0.110 0.148 0.184 0.220 0.255 0.288 30.027 0.055 0.087 0.117 0.148 0.177 0.207 0.236 分别计算加入样品1后邻苯三酚自氧化率：0.066/min 0.066/min 0.068/min 0.065/min 0.061/min 0.061/min 所以：加入样品1后邻苯三酚自氧化率=0.387/6=0.0645/min分别计算加入样品2后邻苯三酚自氧化率：0.076/min 0.076/min 0.074/min0.072/min 0.071/min 0.068/min 所以：加入样品2后邻苯三酚自氧化率=0.43

15、7 /6=0.0728/min分别计算加入样品3后邻苯三酚自氧化率：0.060/min 0.062/min 0.061/min 0.060/min 0.059/min 0.059/min 所以：加入样品3后邻苯三酚自氧化率=0.361/6=0.060/min2 酶活性单位的计算Am样液体积mL反应液总体积mL单位活性U/mL总活性U样品10.0645110550.5618样品20.0728110364.0449样品30.060110651.6854 3 蛋白质含量的标准曲线牛血清蛋白质含量（ug）020406080100吸光度值00.0880.2010.3150.4550.554通过标准曲线的

16、公式y = 0.005x - 0.015可以计算出样品中SOD含量样品加入量(ul)吸光度值SOD含量（ug）1500.551 113.221000.150 3332000.186 40.2 4样品蛋白质含量：样品吸光度蛋白质含量mg样品加入量mL单位蛋白质浓度mg/ml样品10.5110.09370.051.875样品20.1500.02930.10.293样品30.1860.03570.10.360 5结果处理样品单位活性U/ml单位蛋白质浓度mg/ml比活力U/mg样品1550.56181.875293.633样品2364.04490.2931242.474样品3651.68540.3601810.237 6最终结果数据表提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性U/ml总活性U比活性U/mg回收率%纯化倍数除血蛋白上清1.875550.5618293.6331热变性后上清0.293364.04491242.4744.231丙酮沉淀后的0.360651.685