第九章RNA干扰与基因表达

1、第九章 RNA干扰与基因表达lRNA干扰（RNAi）概念：u内源或外源双链RNA（ds RNA）介导的同源mRNA的高效、特异性降解的现象。引起基因转录后沉默。第一节 RNA干扰及其机制 一、RNAi的发现l真菌：基因消融l植物： PTGS（post-transcription gene silencing）l2001 science 10大科学进展l美国科学家Andrew Fire and Craig C.Mello发现，获2006年若奖。二、干扰机制1.RNAi的起始阶段：内源或外源dsRNA导入细胞，在dicer酶作用下切割为siRNA（21-23bp）2. RNAi的效应阶段： siR

2、NA介导靶mRNA的降解。3. RNAi循环放大阶段：微量的dsRNA就可以使RNAi效应遍及整个机体。dsRNA切割生成siRNA，siRNA以靶mRNA为模板，合成dsRNA。三、RNAi的特点1.RNAi是PTGS机制2.特异性：只特异降解与之匹配的单个内源基因的mRNA。3.高效性：体内与体外实验表明，RNAi抑制基因表达具有很高的效率。4.dsRNA长度的局限性： 一般不得短于21bp，长链dsRNA也必须被dicer酶切割为21bp的siRNA。5.可传播性：细胞之间可以长距离传递。6.ATP依赖性7.稳定性dsRNA和 siRNA双链结构，比较稳定8.快捷性：siRNA转染细胞，

3、48h就能观察到靶基因的抑制作用。第二节 RNAi与基因沉默l事实上，siRNA对基因表达调控，包括转录水平，及转录后水平。l转录水平：包括RNA介导的DNA甲基化，异染色质的形成，和DNA分子消融l转录后基因沉默是指siRNA在mRNA水平抑制靶基因的表达。一、转录水平的基因沉默 转录水平的基因沉默（TGS）：mRNA转录尚未启动，siRNA分子通过修饰染色体DNA分子或与其结合的组蛋白，阻止转录的发生。n诱导DNA甲基化n诱导异染色质的形成nDNA分子消融u1.RNAi与甲基化传统认为RNAi只发生在转录后水平，最近研究发现，siRNA也能在转录水平调控基因表达。RdDM（RNA dire

4、cted DNA methylation）：RNA指导的DNA甲基化。1994年，Wassengger在研究一种病毒感染烟草时发现。l在siRNA作用下，基因GC岛中C和组蛋白H3的第9个lys发生甲基化，抑制基因表达。lRdDM是否具有普遍性？哺乳动物的DNA分子甲基化灭活X染色体，可能就是一种RdDM现在。2.RNAi与异染色质的形成线虫中发现，RNAi来修饰染色质，抑制基因表达。具体来讲，是siRNA修饰组蛋白H3第9为lys残基。组蛋白乙酰化，不能与DNA结合，基因活化；组蛋白去乙酰化，与DNA结合，基因表达受抑制。3.RNAi与DNA分子消融（elimination） 四膜虫中最早发

5、现，siRAN介导异染色质形成后，DNA分子会发生消融和重组。l二、转录后水平的基因沉默（ PTGS）1.siRNA介导的RNAisiRNA能诱导靶mRNA降解导致基因沉默。分为启动、剪接、循环放大3个阶段。2.miRNA介导RNAimiRNA是内源性的，能与靶mRNA互补，抑制基因表达。1993年Lee等在一种线虫中发现。pmiRNA的特点：广泛分布，单链，长度21-25bp，较长的miRNA要被dicer切割。pmiRNA作用机制： miRNA是编码基因指导合成。包括前体合成、微处理复合体识别和切割、转运、dicer酶切割、形成RISC（RNA-induced silencing comp

6、lex）、miRNP、与靶mRNA的互补。3.siRNA与miRNA的区别表9-1，（做详细介绍）第三节 RNAi的研究方法l一、siRNA的设计siRNA的反义链与作用的mRNA有严格的互补关系。siRNA只能与靶RNA高度同源性，与其他基因同源性尽可能低。siRNA正义链19bp要与靶mRNA相同，3端UU或dTdT。二、siRNA的制备l1.体外制备法：包括化学合成法、体外转录法、dsRNA体外降解法。l2.体内表达：转染DNA模板在体内表达。siRNA载体、siRNA表达框架在细胞中的表达。3. siRNA的导入磷酸钙沉淀法、电穿孔法、机械法第四节 RNA干扰的应用l一、研究基因功能 与基