PSII反应中心蛋白D1蛋白的磷酸化被内源性昼夜节律控

1、Plant Physiology, 2002影响因子：6.367PSII反应中心蛋白D1蛋白的磷酸化被内源性昼夜节律控制主要内容 1.背景 2.材料与方法 3.结果 4.讨论1.背景 D1磷酸化的光依赖性是高等植物仅有的，而且在蓝藻和藻类中是必要的。光合自养的高等植物少根紫萍 ，生长在温室条件下受到自然昼夜周期下的太阳辐照，PSII磷酸化与总D1蛋白比(D1-P index: D1-P/D1 + D1-P)表明遭受了重复的昼夜震荡。这些震荡明显不在最大光强度时期的阶段内。在D1-P指数最高的时段并不受温度的变化、类囊体膜中的 D1激酶活性的数量/D1蛋白的合成率和光抑制率的影响。 然而，当暗周

2、期在一个正常的昼夜周期通过将植物转移到连续光照条件下而被人为缩短时，D1-P指数时间偏移并在4-5h光照内达到最大。由此产生的昼夜振荡在连续光照下持续了至少两个周期，表明节律是内源性（昼夜节律）的和由外部信号诱导产生的。 光合放氧涉及超分子蛋白色素复合物光系统II。光系统II反应中心包括了D1和D2蛋白异源二聚体，并结合了PSII电子传递链的大多数非蛋白成分 。光对于D1蛋白代谢很重要，调节其的合成，膜内转运，翻译后磷酸化以及酰化，及其降解率。D1蛋白的翻译后磷酸化发生在苏氨酸残基的N末端，通过一个光依赖的氧化还原调节激酶来催化。 蛋白质磷酸化被真核生物用来调节细胞活性。在植物中，蛋白质磷酸化

3、是对环境信号比如伤害和光的关键响应。在植物中磷酸化蛋白的最大浓度在叶绿体膜发现。D1蛋白的磷酸化和去磷酸化是严格光依赖的。捕光叶绿素脱辅基蛋白的氧化还原敏感的可逆磷酸化被认为是通过均衡PSII和PSI的电子流动的最大量子产率机制 可是，D1或其他PSII蛋白的磷酸化的作用在很大程度上是未知的。有人认为磷酸化调控D1蛋白降解，维持它作为替代前的存储形式，或者调节反应中心的二聚体。 光强对D1代谢机制的影响在实验条件下研究，用恒定强度的光强来辐照植物或类囊体膜。通常用完全黑暗的预处理或暴露在不同与最终使用的光强下。恒定光强照射不仅影响D1降解速率，而且影响非磷酸化D1蛋白的磷酸化比率。为了深入了解

4、磷酸化的D1生理功能，我们在一个自然昼夜周期描述这个过程，即用自然波动的阳光强度。找出对合成肽的抗体，能选择性地检测各种形式的D1，磷酸化和去磷酸化D1，并可以在特定条件下测定D1蛋白磷酸化的比率。 温室中的自然光/暗周期下的少根紫萍，表现出总D1蛋白磷酸化比例的昼夜振荡(D1-P index: D1-P/D1 +D1-P)，与体内从头的D1磷酸化一致。当植物从光/暗循环移位到连续光照条件下，D1-P指数节律维持几个周期。这些结果表明D1蛋白磷酸化的昼夜节律调节，是叶绿体膜的一个关键PSII反应中心蛋白。2.材料与方法 植物材料与类囊体膜植物材料与类囊体膜准备准备：Spirodela olig

5、orrhiza 体外磷酸化体外磷酸化 昼夜振荡实验昼夜振荡实验 体内脉冲标记实验体内脉冲标记实验 抗血清的抗血清的制制备备 电泳和电泳和免疫印迹免疫印迹3.结果 磷酸化和非磷酸化磷酸化和非磷酸化D1蛋白的蛋白的翻译翻译 D1-P指数的昼夜指数的昼夜振荡振荡 体内磷酸化体内磷酸化的的D1反应了反应了D1-P指数振荡指数振荡3.13.1磷酸磷酸化和非磷酸化化和非磷酸化D1D1蛋白的蛋白的翻译翻译 体内的光依赖的D1蛋白磷酸化是短暂的并随光强增强而上升。光依赖可在体外再现，通过在氧化还原产生的条件下用铁氧还蛋白和还原力在黑暗中培养离体的类囊体。从少根紫萍提取的类囊体膜在黑暗中培养3天来进行蛋白磷酸化

6、，是在体外磷酸化。亲和纯化的抗体（抗SP1和抗SP 2）测试其能力，用来检测磷酸化和非磷酸化的D1(Fig. 1).。随着孵育时间的增加， ATP,NADPH，铁氧还蛋白和类囊体的暗孵育导致了D1蛋白逐渐的磷酸化。明显分离成两种D1蛋白形式，磷酸化D1（D1-P）,和非磷酸化D1蛋白。抗-SP2识别这两种形式的D1，而抗-SP1只识别非磷酸化形式(Fig. 1B). 抗-SP1不识别D1-P表明比起非磷酸化形式，TAILERR区域的N末端磷酸化形式呈现一个更有条理，受保护的构象。这种磷酸化的构象变化是有据可查的并已在叶绿素蛋白SP29和捕光叶绿素脱辅基蛋白中被诱发。 在可抑制D1激酶活性的DC

7、MU（敌草隆）存在的条件下，植物在光下迅速的去磷酸化D1-P。在这种条件下，非磷酸化和磷酸化D1比率应该上升。这就是在DCMU处理后的样品用抗-SP2和抗-SP1检测的免疫印迹的情况(Fig. 1C,+DCMU)。用相反的方法，在用DCMU抑制磷酸化，D1-P去磷酸化被NaF（一种磷酸酶抑制剂）抑制的条件下，D1和D1-P水平应该保持不变。这种情况是在单独的实验具有抗SP2(Fig. 1C,+DCMU+NaF). 这些观察证实了抗体的特异性和上部和下部免疫反应条带的识别（Figure1, B and C,），分别是D1-P和非磷酸化D1。这些结果与先前的结论是一致的。3.2 D1-P D1-P

8、指数的昼夜指数的昼夜振荡振荡 阳光照射下温室中自然昼夜循环条件下培养的少根紫萍中分离出的类囊体样品，通过免疫印迹并分析了D1和D1-P. 图2中的数据被绘制为D1-P指数，D1的磷酸化形式的百分比，对比时间超过3个光/暗周期。重现的振荡在D1-P指数得到，这显然超过了最大辐射的时期的相位(Figs. 2A, 3, and 4)。因此，本身的光强度不直接与磷酸化D1与总D1蛋白比值相关。 D1-P指数最大值始终在最大光强值之前(Fig. 2A).。 在连续3天和所有其他的条件当试验被重复时，观察24-h振荡(Figs. 3 and 4).。在这些实验中，温室中温度保持不变（Fig.3B）或者被允

9、许上升或下降通过改变光强(Fig. 3A)。如图2a所示的振荡和D1-P指数模式对范围内测得的温度是不重要的(Fig. 3, A & B)。这些数据表明当产生光/暗周期的节律的阶段不太受不同温度的影响。在光周期的最后和黑暗中2h，一些植物被移到连续光照条件下（Fig. 2B)或者5分钟的光脉冲（Fig. 2A 箭头在中间的黑条表示）。暗周期被连续光照打断的植物中生物钟被重置，周期被转移，与D1-P指数峰值出现在植物转移到连续光照4h后(Fig. 2B)。然而，暗周期中施加5Min光脉冲不足以诱发生物钟(Fig. 2A, open rectangles).。结果与脉冲的光强无关。植物随后

10、保持在连续光照，24h振荡的自由运行被维持(Fig. 2B, days 2 and 3).。移位的峰值均低于自然光/暗周期中观察到的振幅。这种阻尼在其他生物系统中相似的情况下被观察到。3.3体内磷酸体内磷酸化化的的D1D1反应了反应了D1-PD1-P指数指数振荡振荡 先前的实验基于D1/ D1-P的免疫学分离来测定D1-P指数。为了确定这些稳态模式是否反映从头磷酸化，D1合成和磷酸化的体内模式用35SMet and 32P正磷酸盐通过昼夜循环测得。D1的磷酸化反映D1-P指数，都在光阶段内达到峰值(at 10am)。与其磷酸化相比，白天过程D1被持续合成，在10h光阶段达到峰值（约为4pm），

11、远远超出了最大的光强度(Fig. 4,强光) 。D1的稳态水平作为定量对这些样品的免疫印迹分析没显示出任何重大的改变。 类似的模式和相同的高峰时间在阴天观测到，在最大温室光照条件下而且得到D1磷酸化，D1-P指数和D1合成的峰。这些光强远低于其光抑制的抑制点。4.讨论 我们证明了除了已知的光系统II的反应中心蛋白D1蛋白的氧化还原反应调节之外，重要的调控是由内在的生物钟引导。D1磷酸化的昼夜节律遵循基本的生理节律参数，即它有一个24小时的周期。在大多数的昼夜节律系统，光是一个主要信号来诱导每天光/暗周期的节律活动通过重置生物钟的时段而不改变周期长度。对于D1-P指数似乎也是如此。生物钟通过用连

12、续光照阻断暗周期被重置。因此，似乎光能重置这个时段然后和生物钟一起调节体内D1磷酸化。完全黑暗中D1-P指数的节律行为的不持续性可能因为光是大部分的叶绿体活动绝对需求的事实，尤其是D1动态。 在黑暗中能使磷酸烯醇丙酮酸羧化酶磷酸化的激酶的昼夜节律调节是有据可查的，并运用在与转录物积累有关的蛋白质丰富度水平。在我们的研究中，体内D1磷酸化的振荡不被体外D1-多肽激酶活性（在整个白天过程中几乎保持不变 数据未显示）反映，D1蛋白合成率持续上升直到下午很晚的时间，或光抑制。因此，振荡是内源性调节物控制D1的代谢和功能的指示者。 D1磷酸化的昼夜节律控制增加了另一个层面对尚未解决的叶绿体功能中光依赖的

13、D1蛋白周转或D1的磷酸化的作用。D1的磷酸化已被表明是关闭PSII的手段，或改变电子传递途径，来保护光合系统避免由强光引起的损伤。然而，磷酸化的最大程度发生在最大光强度数小时前，在光强远低于饱和光合作用或光抑制启动的光强度。 我们注意到，D1降解速率在黑暗中最小但在光强增强的白天上升。可能D1磷酸化的昼夜节律振荡是能够控制光合器官的运行的调控机制的组成部分，也是改变D1蛋白代谢的信号。Riesselmann和Piechulla（1992）提出，光周期中蛋白质受损可能被随后的白天的光周期最开始时取代。如果这个机制是在一个内源的，昼夜节律的控制下，可能在早上恢复类囊体膜蛋白复合物以能够在白天进行

14、最适光合反应。 能够使D1蛋白磷酸化的蛋白激酶位于叶绿体膜上，但是可能被核基因编码，因为叶绿体基因组中没有类激酶基因的开放阅读框。D1蛋白磷酸化的内源节律不能反映类囊体中激酶活性的数量。可能D1激酶的活化（质体醌的氧化还原）状态或磷酸酶可能相关。 然而，无论它是氧化还原反应还是激酶直接调节的结果，结果仍是D1磷酸化的生物钟调节。可能的核D1激酶基因或它的基因产物的表达的昼夜调节，可以提供一个通讯机制，通过该机制核内的生物钟采用核编码的蛋白激酶调节叶绿体的功能。这或许是叶绿体预测环境变化的方式。对光合作用过饱和的光强导致了叶绿体中的有害影响；因此感测机制有必要下调PSII。叶绿体如何实现这一点尚

15、未可知。它是使用D1-P指数作为传感器来预测的更高的光强度的开始？PSII反应核心蛋白的磷酸化状态是否作为有氧光合系统两个光系统的相对能量分配的结果或决定因素？因为光照依赖的D1周转是D1无可争辩的事实和因为光养生物通常进行日常的光/暗周期，D1代谢的昼夜节律的调节并不意外。 然而，不同光合形式如何实现调节可能有所不同。在高等植物中，D1能够进行可逆的磷酸化，代谢的昼夜节律调节可以在磷酸化水平，正如少根紫萍。在蓝藻，D1的氧化还原调控的磷酸化似乎没有发生，但这些光合产氧细菌往往具备psbA基因编码的D1的多个拷贝，不同的D1同工型适应于在体内不同光子照射，一个主导的在低光强和另一个在更高的光的

16、强度。一些研究表明蓝藻psbA基因的光诱导转录发生节律控制的更大范围内。因此，广义的假设可以是高等植物中D1的可逆磷酸化（可能是其他的PSII蛋白磷酸化）进化地取代蓝藻多个DNA拷贝作为更节能的基底对于PSII核心代谢的生物钟调节。 该假说可以系统地研究通过观察非典型物种。原绿球藻马里努斯，无处不在的，非寄生的海洋蓝藻，是异常的因为它包含了叶绿素a,b,c，但是没有藻胆体。此外，它仅具有一个psbA基因和1种类型的D1蛋白。要确定D1是否可以被磷酸化在这个有机体是有趣的。D1在低等植物和藻类的磷酸化状态和也需要进一步的调查。在体内或体外条件下强光条件下，苔藓类角齿藓的D1蛋白被报道是不被磷酸化的。然而，这个低等植物模型的基因拷贝数和D1代谢的调节是目前缺乏的。衣藻的文献中虽然广泛，但是关于D1和D2蛋白磷酸化很不清楚。最近的研究表明，这个绿藻中的这些PSII核心蛋白都不被磷酸化。莱茵衣藻的psbA基因映射到反向重复区域