成人骨髓间充质干细胞对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

1、成人骨髓间充质干细胞对脐血cd34+细胞 的体外扩增作用:贾明峰,侯相麟，赵丽，刘蓿，李娟，陈轩【关键词】骨髓细胞【abstract aim: to investigate the effects of adult bone marroesenchymal stem cells on the expansion of umbilical cord blood cd34+ cells ex vivo. methods: adult bone marroesenchymal stem cells bilical cord blood cd34+ cells esenchymal stem cell

2、s, stem cell factor, interleukin 11 and granulocytemacrophage colony stimulating factor, respectively. at the end of 3 ber of nucleated cells , colony forming cells and cd34+ cells for 3 esenchymal stem cells and cytokines coculture systems significantly enhanced the expansion of the cord blood cell

3、s ber of nucleated cells by 114.2±2.4fold, colony forming cells by 40.5±8.6fold and cd34+ cells by 11.3±0.4fold, respectively. conclusion: the expansion of umbilical cord blood cd34+ cells can be enhanced ex vivo by adult bone marroesenchymal stem cells bined plification; cd34+ cell;

4、cord blood; bone cells; stem cells【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞(mscs)对脐血cd34+ 细胞体外扩增作用.方法：分离培养成人mscs作为滋养层，联合 scf, il11和gmcsf分别组成对脐血cd34+细胞的不同扩增体系， 培养3 esenchymal stem cells, mscs)作为骨髓造血微环境中的一种 重要细胞成分，近年来成为干细胞研究领域的一大热点.mscs具有自 我更新和多向分化潜能，在体外可被诱导分化为多种结缔组织及部 分于外胚层的组织，形成骨、软骨、骨骼肌、腱、韧带、真皮、脂 肪、骨髓基质和神经1,2 此外，还分泌多种生长因子支

5、持骨髓 造血，藉此mscs可在体外作为滋养细胞层进行造血干/祖细胞扩增. 自脐血(umbilical cord blood,ucb)中发现造血干细胞(hematopoietic stem cell,hsc)以来，脐血hsc移植用于治疗恶性及非恶性血液病日 益广泛，但单份脐血所含的造血细胞不足以满足成人的移植所需， 大量扩增后才能用于移植.鉴于此，我们探讨了来自成人的mscs 对脐血cd34+细胞的体外扩增作用.1材料和方法1.1材料正常成年男性献骨髓者2例，健康足月分娩儿脐血14例，取自 兰州市慈和堂医院和本院妇产科.percoll分离液(密度1.073 kg/l), 淋巴细胞分离液(密度1.

6、077 kg/l)，马血清(hs)均购自tbd公 司；dmemlg 培养基购自 paa lab (germany)； imdm 购自 gibco 公司;胎牛血清(fbs)为杭州四季青公司产品;bsa、甲基纤维素、b 毓基乙醇及l谷氨酰胺购自sigma公司；重组人干细胞因子 (rhscf),重组人白细胞介素11 (rhilll),重组人粒细胞巨噬细 胞集落刺激因子(rhgmcsf),重组人粒细胞集落刺激因子 (rhgcsf)，重组人红细胞生成素(rhepo)均购自peprotech公 司；荧光标记的抗cd34单克隆抗体(cd34pe)购自coulter immunotech公司；抗cd29, c

7、d44, cd45和抗hladr单克隆抗体 购自pharmingen公司.1.2方法1.2.1mscs的分离纯化及培养mscs的分离纯化及培养按文献3 介绍的方法进行收集正常肝素抗凝骨髓约10 ml,用percoll 溶液梯度离心,900 g 30 min,收集中间相为有核细胞,然后将细胞按2 x 108 /l密度接种于dmemlg培养基(含100 ml/l fbs, l谷氨酰 胺，青霉素105 u/l,庆大霉素8x104 u/l)的塑料培养瓶中，37°c, 50 ml/l co2饱和湿度孵箱中培养,72h后更换培养基，以后每34 d 换液一次.当贴壁细胞达90%以上融合时，用2.5

8、 g/l胰酶0.2 g/l edta消化后传代培养.传代第3代以后用于以下实验.1.2.2mscs表面分子测定用2.5 g/l胰酶0.2 g/l edta消化收获 细胞，至少2x105个细胞与抗cd29, cd44, cd45, hladr抗体室温 反应30 min, pbs洗涤2次，后与fitc标记的二抗避光反应15 min.细胞洗涤后悬浮于pbs中，coulter epics xl流式细胞仪分析 相关数据.1.2.3脐血的采集、单个核细胞分离及cd34+细胞含量测定收集 正常足月新生儿脐血,4°c保存运输，于4 h内用淋巴细胞分离液分离 单个核细胞(mononuclear cel

9、ls, mnc)取100 p l mnc悬液上机 检测cd34+细胞含量，具体方法是：取阴性对照(mouse iggl) 与荧光标记的cd34单抗(cd34pe)各20 m l于试管底部，再分 别加入100 ul细胞悬液室温避光孵育15 min,后用qprep(全血细 胞制备仪)处理细胞，于测试管内加100 u l flol/l fbs, 125 ml/l 马血清，各种人细胞生长因了(scf 50 ug/l, il 11 50 u g/l, gmcsf 2 ug/l).脐血mnc,cd34+细胞与msc共培养体系为： mnc按1.0x 1011/l接种于铺满mscs滋养层的24孔板中，每孔1

10、ml, 33°c, 50 ml/l co2和饱和湿度的培养箱中连续培养3 l/l hs, 10 g/l bsa, 2 mmol/l l 谷氨酰胺,1 x 10-4 mol/l 0 铳基乙醇(2mp) , rhscf 50 u g/l, il 11 50 u g/l, gmcsf 20 u g/l, g csf 20 u g/l, epo 3000 u/l和9 g/l甲基纤维素.培养在24孔培养板中 进行，37°c, 50 ml/l co2和饱和湿度条件下连续培养14 d.每周在 倒置显微镜下直接计数集落形成细胞(colonyforming cells,cfcs) , 240

11、个细胞为1个集落.统计学处理：数据用x±s表示，采用spss8.0统计软件作重复 测量资料的方差分析，p&lt；0.05认为有统计学意义.2结果2.1msc的形态学特征及表面抗原特性经percoll分离液分离后 培养的骨髓单个核细胞，大部分于24 h内即贴壁，倒置显微镜下， 细胞呈圆形有小的胞质突起.72 h后，大多数细胞有胞质突起 1 sc 表面分子显示，cd34, cd45, hladr等为阴性，cd29, cd44等为 阳性，并且传代前后msc形态及表面标志一致.2.2脐血中mnc总数、cd34+细胞含量测定本组14份标本中有核 细胞含量个体差异较大，其中mnc总数为

12、(6.36±2.12) x 109/l 参考值范围(2.2415.80) x109/l ,流式细胞仪检测的cd34+ 细胞含量为 (21.2±2.9) x 106/l 参考值范围(13.730.2) x 106/l,体积差异也较大，中位体积55 ml (参考值范围35120ml).2.3msc对脐血nc总数、cfcs的扩增作用不同的扩增体系在 体外连续观察3dar等4检测人msc的基因表达及不同诱导条件 下msc细胞因子的表达水平变化及其对hsc的支持作用发现， msc表达il11, lif, mcsf及scf的mrna这些细胞因子都是很 重要的造血生长因子，它们是msc参

13、与造血调控、支持造血的物质 基础.近年来脐带血hsc移植的例数在逐年增加，但由于单份脐血 所含造血细胞数量少，不能满足成人患者移植的需要，故许多研究 者尝试通过各种体外扩增的方法提高脐血移植的细胞数.本研究基 于msc体外支持长期造血的特性，外加细胞因子观察了其对脐血 cd34+细胞的体外扩增作用.msc经分离、培养和纯化三代后用作 饲养层，根据是否加用scf, il11和gmcsf分为三组不同扩增体系 培养 3 an marroal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intrace

14、llular cyclic amp j j biochem biophys res mun, 2001;282:148-152.2 mingull jj, conget p, erices a. biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells j braz j med res, 2003;33： 881-8873 majumdar mk, thiede ma, mosca jd, et al. phenotypic and functional parison of cultures of maitoesenchymal stem cells (mscs) and stromal cells j j cell physiol, 1998;176:57-66.4 majumdar mk, thiede ma, haynesan marroesenchymal stem cells ( mscs ) express hematopoietic cytokines and support longterm hematopoiesis al and osteogenic lineages j hematotherstem cell res, 2000;9： 841.5 lazzari l, lucchi