第四组实验血清GPT活性测定

1、血清谷丙转氨酶活力的测定血清谷丙转氨酶活力的测定（改良赖氏法）（改良赖氏法）实验目的实验原理实验试剂实验操作实验目的实验目的 1.了解血清谷丙转氨酶活力单位的定义。 2.掌握血清谷丙转氨酶活力测定的方法及临床意义。临床意义临床意义 谷丙转氨酶，又名谷氨酸转氨酶(GPT) 、丙氨酸氨基转移酶(ALT)。肝脏是人体最大的解毒器官，该脏器是否正常，对人体来说是非常重要的，GPT升高是肝脏功能出现问题的一个重要指标。 GPT主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。因此，GPT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。但它并

2、不具器官专一性，许多疾病都可以引起它的增高，明显升高见于急性病毒性肝炎，中度升高见于慢性肝炎、肝硬化活动期、肝癌、肝脓肿， 心梗、心肌炎、心衰等也可轻度升高。部分GPT升高与脂肪肝、饮用酒精有关。临床常用的保肝药物较多。有些药物的治疗效果较好但容易反复，致使一些肝脏疾病长期不能治愈，大量的肝细胞遭受破坏。如何保护肝细胞，是保护肝脏功能的关键所在。谷丙转氨酶的正常参考值为540 U/L背景知识背景知识转氨基作用：转氨基作用： 指的是在转氨酶的催化下，可逆地把-氨基酸的氨基转移给-酮酸，结果是氨基酸脱去氨基生成相应的-酮酸，而原来的-酮酸则转变成另一种氨基酸。GPT活力测定的不同方法活力测定的不同

3、方法一.卡门氏分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如下： 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为一般临床化验室推广。二.比色测定法，如：金氏法（King法）、穆氏法（Mohun 法）和赖氏法（Reitman-Frankel法）。其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同。不同之处在于作用时间：金氏法60min 、穆氏法和赖氏法30min。因此它们的单位定义和标准

4、曲线制备也不同。本次实验的方法：改良赖氏法本次实验的方法：改良赖氏法卡氏测定ALT活力的原理:丙氨酸+ -酮戊二酸 ALT 谷氨酸+丙酮酸 丙酮酸+NADH 乳酸脱氢酶 乳酸+NAD+赖特曼改用2.4-二硝基苯肼与丙酮酸显色测定丙酮酸含量，故称为赖氏法。改良赖氏法继承了赖氏法的测定方法与卡门法的酶单位定义，用赖氏法的分光光度数据与对应的卡门单位数作标准曲线，对比测定酶的活性，结果比较准确。GPT GPT 酶活力单位的定义酶活力单位的定义卡门氏单位定义为：1ml血清(反应溶液总量为3ml)，在25，1min内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH + H+变成NAD+，在340nm波长下，

5、用内径为1.0cm的吸收池，光密度每下降0.001为1个氨基转移酶活力单位。金氏法单位定义是：每1ml血清在37条件下与底物作用60 min，生成1mol丙酮酸称为一个单位。 穆氏法单位定义是：每毫升血清在pH=7.4，37条件下与底物作用30 min，每生成2.5微克丙酮酸为1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速率法的卡门氏单位作表示的。实验原理实验原理 血清中的谷丙转氨酶（GPT），在37、pH7.4的条件下，可催化底物液中的丙氨酸与-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸生成的丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，产生丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性环境中呈现红棕色，颜色的深浅与丙

6、酮酸的含量成正比。根据丙酮酸的生成量，即可计算GPT活性的大小。实验试剂实验试剂1.GPT底物液(2mmol/L-酮戊二酸，20mmol/L L-丙氨酸) 称取分析纯-酮戊二酸29.2mg，L-丙氨酸1.78g ,先用50ml磷酸缓冲液(pH 7.4)溶解，然后用1mol /LNaOH校正pH至7.4(约0.5ml)，再以pH 7.4的磷酸缓冲液稀释至100ml，加氯仿数滴，防止变质。 2.磷酸缓冲液（PBS 0.1mol/L pH 7.4） 称取Na2HPO413.97g，KH2PO42.69g，溶解于dH2O中，稀释至1000ml。3.丙酮酸标准液（2.0mmol/L） 取标准丙酮酸钠22

7、mg，用磷酸缓冲液准确定容为100mL。此液须当日用当日配。4. 2.4-二硝基苯肼溶液 (1mmol/L) 称取2,4-二硝基苯肼19.8mg，先溶于10mL 10 mol/L HCL中，溶解后加水至100mL。5. 0.4mol/LNaOH.实验操作实验操作1.1.标准曲线绘制标准曲线绘制: :(1)取试管5支，按表6-8操作。(2)混匀，室温放置10min后，以蒸馏水调零 ，用520nm波长比色，读取各管光密度。各管的吸光度（An）减去0管的吸光度（A0），然后以吸光度的差值（An-A0）为纵坐标，各管相应的氨基转氨酶活力单位为横坐标，绘制标准曲线。试剂试剂01234丙酮酸标准液/ml0

8、.000.050.100.150.20GPT底物试剂/ml0.500.450.400.350.300.1mol/L磷酸盐缓冲液pH7.4/ml0.100.100.100.100.102,4-二硝基苯肼液/ml0.500.500.500.500.50 混匀， 置37水浴20 min0.4mol/LNaOH/ml5.005.005.005.005.00相当于GPT活性/卡门氏单位0285797150 2. 2. 酶活力的测定酶活力的测定:(:(1)取2支试管，注明测定管（T）和对照管（C）,在测定前将底物液在37水浴中预温5min,再按下表操作。（2）混匀，室温放置10min后，以蒸馏水调零，用5

9、20nm波长比色，读取吸光度，用T管的吸光度减去C管的吸光度(At-Ac)，查标准曲线，即可得到待测血清中ALT的活性。试剂试剂/ml测定管测定管(T)对照管对照管(C)血清0.1 GPT底物液0.500.50混匀，置37水浴中保温30min2,4-二硝基苯肼液0.500.50混匀，置37水浴中保温20min血清 0.10.4mol/LNaOH5.005.00实验评价实验评价1. 重复性差，其原因有三：由于限制底物-酮戊二酸的用量，如一般采用2.0mmol L 的浓度下，反应速度只有最大反应速度的 65 ，使产物生成量与酶的活性之间不能呈现良好的线性关系。 2,4- 二硝基苯肼在碱性条件下也能显色，为了降低试剂空白的吸光度而不得不使用低浓度的 2,4- 二硝基苯肼(1.0mmol L) 。此种水平的 2,4- 二硝基苯肼仅能与反应体系中的两种酮酸的一半反应。产物旁路效应：即 ALT 催化生成的产物丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化而消耗，从而影响测定结果。这种现象称为