电镜第四、五、六章

1、第四章 电镜制样一、SEM的样品制备一、SEM的样品制备 固定脱水干燥导电处理 自然干燥，真空干燥，冷冻干燥，临界点干燥。 冷冻干燥：冷冻干燥： 是指生物样品可通过快速冷冻使包含大量水分的软组织冰冻硬化，将原始组织固定下来，然后表面水分升华达到冷冻干燥的目的。其过程大致为： 冷冻干燥的优点在于可以保持样品的原始形态，缺点是冰晶对细节有损伤，内部升华的水会破坏导电膜，观察时间不能太长。 临界点干燥：临界点干燥： 是基于物质的一种临界状态的特性形成的。物质有气、液、固三态。在一定的温度和压力条件下可相互转换。调整温度和压力，是气态的密度与液态的密度相等，两者的界面消失，也就不存在界面张力。样品经过

2、临界点干燥仪的处理，即可保持原始形态，然后镀膜观察。样品（生物组织）液氮冷冻台镜筒真空镀膜观察1.）真空蒸发： 在真空条件下，利用高温把镀材加热熔化，形成金属蒸气，喷涂在样品的表面，蒸镀的金属有金（Au），银（Ag），铂（Pt），铝（Al），铜（Cu）。如果要做x-ray成分分析则只能镀碳（考虑到重元素对轻元素x-ray的吸收）。2.）离子溅射法 真空容器内，在高压1500V的作用下，残留的气体分子被电离，形成等离子体，阳离子在电场加速下轰击金属钯，使金属原子溅射到样品的表面，形成导电膜。+钼舟碳棒固定 脱水环氧树脂浸透 低温处理（液氮） 树脂固化（二甲基亚砜） 脆断 去树脂固化 临界点干燥

3、喷镀 观察 3.）冷冻断裂（组织观察中一个很有用的技术） 利用冷冻干燥，临界点干燥和镀膜技术以取得新鲜断面的原始形貌。 二、TEM的样品制备 1. 样品的支撑：厚度在200左右的支持膜上，载网。1.）载网：为铜网，分别有50目，75目，150目，200目，250目，400目等等（目是指每英寸长度包含的孔数）。 图图6-1 铜网示意图铜网示意图 2.）支持膜：厚度为200左右的有机膜对电子透明。a. 火棉胶 C12H11O22N6，配成13的醋酸戊酯溶液，先在水平面上成膜，利用表面张力把铜网置于膜上，网上放滤纸，全部湿润后揭开即可。 b. Formar膜 聚乙烯醇缩甲醛，有较好的强度，配成0.2

4、0.5的氯仿溶液Formar膜水滤纸上扩散至网上 2. 反差的增强 1.）负染：重金属试剂进行染色，样品亮而周围暗。 病毒，细菌，纤维蛋白以及分离的细胞器等都可以用这种方法。 2.）正染：使重金属与组织中某些成分结合或被吸收，与周围背景之间的反差得到增强。可用12醋酸铀溶液在37时染色5分钟，也可在柠檬酸铅中进行复染数分钟。 3.）投影：高密度的金属，以一定的角度沉积到样品台上面向蒸发源的区域，背向蒸发源的区域形成“阴影”，加深了立体感。 样品影长1：3 投影材料可以是金钯，铂铑，铂铱等。 对于软体的，富有细微结构的生物样品必须经过固定处理，以便把活体状态所有各部位的细节，甚致分子结构尽可能真

5、实地保留下来，常用的固定剂有： 1.） 戊二醛 起还原作用，可稳定糖元，同时可固定组织中的蛋白质，有利于使组织坚韧，但不易固定脂类。固定时间从几十分钟到几小时不等。 2.）锇酸：主要对生物组织起氧化作用。与某些蛋白质形成交联，稳定蛋白质。与几乎所有细胞成分形成复合物，并使其稳定。与细胞膜，线粒体，细胞浆的颗粒亲和力强。能比较完好的保存细微结构。金属锇还能提高样品的反差。 固定时间：小块样品 0.51h 大块样品 2h 际操作时，可将戊二醛固定作为前固定，锇酸固定为后固定，此称为双固定（注意如果要做微区成分分析则严禁用俄酸固定）。 3. 固定4. 脱水 用有机溶剂取代样品中的水分，采用阶梯脱水，

6、即溶剂的浓度从30，50，70，90，95，100逐级增加以吸干水分，以减少变形。5. 包埋：将处理后的组织块用塑料或树脂包埋，这种聚合块在切片时能作为样品的支柱，确保不会使超微结构发生变形。6. 切片： 在专用超薄切片机上进行，厚度可以达到500左右，放在载网上进行观察。 TEM生物制样的一般程序：活体取材 戊二醛前固定 锇酸后固定 脱水 渗透 包埋 聚合 切片 切片 染色 观察 硬样品，如骨头，牙齿，金属等可以采用线切割 离子减薄 双喷 第五章第五章 电镜在生物学和化学方面的应用电镜在生物学和化学方面的应用 EM适用于观察几乎所有动植物的器官，组织，如肝脏，结缔组织，神经，肌肉以及毛细血管

7、等。 EM在生物学上的应用主要包括以下几个方面： 1. 细胞生物学细胞生物学 EM可以容易地对各种细胞膜，细胞器进行研究，并研究各种细胞器的精细组织结构，以及组成细胞器的分子结构，下面就简单介绍一下： a. 细胞膜的双分子层结构 710nm b. 线粒体的三维嵴结构，以及膜面85的复合酶粒子 c. 细胞中可收缩蛋白质形成的微管，微丝，直径为20 30nm(管), 5060（丝）。 d. 内质网上的蛋白体，直径约150。 e. 糖元，直径约150300 。 f. 神经传导器官：化学突触，150 ；电突触，30 2. 分子生物学分子生物学 1.） TEM研究蛋白质： 一种是单个分子的观察，分辨率可

8、达5 。电子衍射和三维重建的方法来解析蛋白质结晶体的分子结构。 2.） 酶的结构 用EM方法研究酶分子的四级结构，比较成功的有几十种，如谷氨酰胺合成酶，其分子量为600000，可以观察到三角形的12面体，直径为140 ，三角形厚90 。 3.） 核酸（DNA,RNA）的结构 核酸分子的形状，大小和长度在电镜下可清晰地呈现。 例如，一步稀释法：利用细胞体的内外渗透压差，是其破裂，内部的核酸？破而出，伸展开来，整个核酸丝是一个？态的分子。总长4050m，核苷酸之间的距离约为5.2 ，只要测得长度就可以算出DNA的分子量。 图图7-1 核酸分子在电镜下的示意图核酸分子在电镜下的示意图 4.） 病毒病

9、毒 病毒是一类最简单的生物，没有独立的能量系统和代谢系统，只由最基本的生命物质，蛋白质核酸组成。病毒很小，直径一般在3000 以下，最小的病毒只有100 。但是病毒的种类很多，而且形态特征很明显。a. 球形病毒b. 杆状或棒状病毒c. 丝状病毒d. 带尾状病毒 观察病毒是通常采用负染技术制样，EM三维重建方法可看到：整体形态，蛋白质亚单位以及分子的螺旋排列。EM在化学中的应用v在无机化学方面的应用在无机化学方面的应用 观测晶体形态,粉末的粒度 1. 碳纳米管的化学镀银SEM研究 经过敏化，活化处理以后的纳米管在硝酸银和氨水中镀银，SEM监控镀银条件，pH值，液液组份的比例 2. 环境扫描，可以

10、模拟不同环境，如l类大气环境，也可以是特殊的气体和温度环境。中科院的冶金所进行了以下研究工作：用纯铁，铁和镍在不同温度和不同氧分压（10-445Pa）下，观察氧化晶粒和晶须的生长过程。 v在分析化学中的应用在分析化学中的应用 1. 催化剂， SiO2单晶担载Na, W, Mn以后，通过截面观察可以了解这些组分向SiO2基体的扩散过程2. 电极表面修饰物的形态 单细胞释放神经递质的检测 纳米电极表面修饰纳米管。 v在有机化学上的应用在有机化学上的应用 1. 高分子聚合材料，多孔材料，一级孔， 二级孔，以及孔径分布情况如何。 2. 高分子复合材料，改性材料 两相间的相容性，形变过程中二次相的流变性，两相界面的结合状态，断裂性质等。 如： 1. 聚乙烯碳酸钙 填充高分子材料 2. 聚丙烯乙丙橡胶 高聚物共混材料 3. 尼龙碳纤维 4. 生物降解：降解前后的形