_食品中大肠菌群的测定

1、 培养特性： 记录在记录在24h 24h 和和48h 48h 内产气的内产气的LST LST 肉汤管数。肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复产气者则进行复发酵试验发酵试验。 大肠杆菌大肠杆菌0157显色显色培养基上培养基上的菌落的菌落在伊红美兰乳糖在伊红美兰乳糖琼脂（EMB）上）上 大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征大肠菌群在去氧胆酸钠琼脂上的典型特征 典型菌落为红典型菌落为红色色 , 菌落周围菌落周围有红色的胆盐有红色的胆盐沉淀环。菌落沉淀环。菌落直径为直径为 2-3mm 或更大。或更大。 大肠菌群在结晶紫中性红琼脂大肠菌群在结晶紫中性红琼脂(VRBA)上

2、典型特征上典型特征 典型菌落为紫典型菌落为紫红色红色 , 菌落周菌落周围有红色的胆围有红色的胆盐沉淀环。菌盐沉淀环。菌落直径为落直径为 0.5mm 或更或更大。大。 大肠杆菌在大肠杆菌在MFC琼脂上的典型特征琼脂上的典型特征 试验流程试验流程1 1、 样品的稀释样品的稀释按第一法中的稀释方法进行。按第一法中的稀释方法进行。（1 1） 选取选取2 2个个3 3个适宜的连续稀释度个适宜的连续稀释度，每个稀释，每个稀释度接种度接种两个无菌平皿两个无菌平皿，每皿每皿1m1mL L。同时分别取。同时分别取1m1mL L生生理盐水加入两个无菌平皿理盐水加入两个无菌平皿作空白对照作空白对照。（2 2） 及时

3、将及时将15 mL-20m15 mL-20mL L冷至冷至46 46 的的结晶紫中性结晶紫中性红胆盐琼脂（红胆盐琼脂（VRBA VRBA ）约倾注于每个平皿中。小心约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，后，再加再加3 mL-4m3 mL-4mL LVRBAVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，覆盖平板表层。翻转平板，置于置于3636l l 培养培养18h-24h 18h-24h 。2 2、 平板计数平板计数 （3 3） 平板菌落数的选择平板菌落数的选择选取菌落数在选取菌落数在1515-150-150 之间的平板，分别计数

4、之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典典型菌落型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为淀环，菌落直径为0.5 mm 0.5 mm 或更大。或更大。2、 平板计数平板计数 （4 4）、）、 证实试验证实试验 从从VRBA VRBA 平板上挑取平板上挑取10 10 个个不同类型的不同类型的典型和典型和可疑菌落可疑菌落，分别移种于，分别移种于BGLBBGLB 肉汤管内，肉汤管内，36361 1 培养培养24h-48h24h-48h ，观察产气情况。凡，观察产气情况。凡BGLB BGLB 肉汤管肉汤管

5、产气产气，即可报告为，即可报告为大肠菌群阳性大肠菌群阳性。2、 平板计数平板计数（5 5）大肠菌群平板计数的报告）大肠菌群平板计数的报告 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3 3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。即为每克（或毫升）样品中大肠菌群数。2、 平板计数平板计数例：例：10-4样品稀释液样品稀释液1 mL，在，在VRBA平板上平板上有有100个典型和可疑菌落，挑取个典型和可疑菌落，挑取 其中其中10个接种个接种BGLB肉汤管，证实有肉汤管，证实有6个阳个阳性管，则该

6、样品的大肠菌群数为：性管，则该样品的大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105 CFU/g（mL）。）。国标国标4789.3的的08版与版与03版主要不同版主要不同1 1、名称更改、名称更改 以以大肠菌群计数大肠菌群计数代替原来的代替原来的大肠菌群测定。大肠菌群测定。2 2、增加增加了大肠菌群的了大肠菌群的平板计数法和纸片检测法。平板计数法和纸片检测法。3 3、大肠菌群的、大肠菌群的MPNMPN法以法以乳糖为主乳糖为主改为以改为以月桂基硫月桂基硫酸盐胰蛋白胨（酸盐胰蛋白胨（LSTLST）肉汤为主）肉汤为主的要培养基的的要培养基的MPNMPN法。法。4 4、大肠菌群的、大肠菌群

7、的MPNMPN法中原法中原“报告每报告每100 ml 100 ml （或（或g g）大肠菌群的大肠菌群的MPNMPN值值”改为改为“报告每报告每1 ml 1 ml （或（或1g1g）大肠菌群的大肠菌群的MPNMPN值值”。比较区别比较区别GB/T4789.38 - 2008大肠杆菌的计数大肠杆菌的计数03版版 流程流程 一、一、 步骤步骤 取样及稀释方法与菌落总数检验方法取样及稀释方法与菌落总数检验方法相同相同，做成做成1:10的均匀稀释液为检样。的均匀稀释液为检样。同一稀释度在做菌落总数测定的同时接同一稀释度在做菌落总数测定的同时接种乳糖胆盐发酵管，并且用大肠埃希氏种乳糖胆盐发酵管，并且用大

8、肠埃希氏菌、产气肠杆菌混合菌种作对照菌、产气肠杆菌混合菌种作对照 。 1、乳糖发酵试验乳糖发酵试验 根据食品卫生要求或对检样污染根据食品卫生要求或对检样污染程度的估计，选择程度的估计，选择三个稀释度三个稀释度，每个稀，每个稀释度接种释度接种三管乳糖胆盐发酵管三管乳糖胆盐发酵管。 接种量在接种量在1ml以上者以上者，用用双料乳糖胆双料乳糖胆盐发酵管盐发酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用单料乳糖单料乳糖胆盐发酵管胆盐发酵管，同时用大肠埃希氏菌和产气肠，同时用大肠埃希氏菌和产气肠杆菌混合菌种混合接种于杆菌混合菌种混合接种于1支作单料乳糖胆盐支作单料乳糖胆盐发酵管对照。发酵管对照。置置361温箱

9、培养温箱培养242小时小时，如所如所有发酵管都有发酵管都不产气不产气，则可报告为则可报告为大肠菌大肠菌群阴性群阴性，如如有产气者有产气者，则与对照的混合则与对照的混合菌种一起菌种一起按下列程序进行按下列程序进行。 2、分离培养分离培养 将产气的发酵管分别在将产气的发酵管分别在伊红美兰琼脂伊红美兰琼脂（EMB琼脂）平板上划线分离。然后置琼脂）平板上划线分离。然后置361温箱内，培养温箱内，培养1824小时小时后取出后取出，观察观察菌落形态菌落形态，并作并作革兰氏染色革兰氏染色和和证实证实试验试验。 可疑菌落特点：可疑菌落特点：具有金属光泽的深紫黑色菌落；具有金属光泽的深紫黑色菌落；不带或略带金属

10、光泽的菌落；不带或略带金属光泽的菌落；中心色较深的淡紫黑色菌落。中心色较深的淡紫黑色菌落。3、证实试验证实试验 在上述平板上挑取可疑大肠菌落在上述平板上挑取可疑大肠菌落12个进行个进行革兰氏染色革兰氏染色，同时接种同时接种乳糖乳糖发酵管发酵管，置置361温箱培养温箱培养242小小时时,观察产气情况观察产气情况，凡凡乳糖管产气、革兰乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告即可报告为为大肠菌群阳性大肠菌群阳性。 4、报告报告 根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每表，报告每100ml（g）大肠菌群）大肠菌群的的MPN值。值

11、。 二、结果二、结果根据证实大肠菌群的阳性管数根据证实大肠菌群的阳性管数，查查MPN检索表检索表(见附录见附录)报告每报告每100ml(克克)大大肠菌群的最可能数肠菌群的最可能数。三、注意事项三、注意事项1、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的、第一步乳糖胆盐发酵试验是样品的发酵结果，发酵结果，不是纯菌的发酵试验不是纯菌的发酵试验，初发，初发酵阳性管，经过后两步，有可能成为阴酵阳性管，经过后两步，有可能成为阴性。只做一步，会有相当多的合格样品性。只做一步，会有相当多的合格样品作为不合格处理，应注意。作为不合格处理，应注意。 2、胆盐胆盐可抑制可抑制革兰氏革兰氏阳性菌的生长，阳性菌的生长，有利于大肠杆

12、菌的生长繁殖。有利于大肠杆菌的生长繁殖。 3 3、接种量在、接种量在1ml以上者以上者，用用双料双料乳糖乳糖胆盐发酵管胆盐发酵管，1ml及及1ml以下者以下者，用用单料单料乳乳糖胆盐发酵管。糖胆盐发酵管。 4、大肠菌群菌落在、大肠菌群菌落在EMB琼脂上琼脂上大多呈大多呈紫紫黑色有金属光泽或无金属光泽黑色有金属光泽或无金属光泽。应。应取典型菌落，取典型菌落，如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。如无应多取几个菌落，以免出现假阳性。 一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，一般平板上有较多的大肠杆菌典型菌落，且且革兰氏染色革兰氏染色为阴性，可做出判定。为阴性，可做出判定。 5、对初发酵时未产气的发酵管、

13、对初发酵时未产气的发酵管有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，有疑问时，可用手轻轻敲动或摇动试管，如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产如有气泡沿管壁上升，应考虑有气体产生，做进一步试验。生，做进一步试验。 6、 MPN检索表是采用三个稀释检索表是采用三个稀释度九管法，较理想的结果是度九管法，较理想的结果是最低最低3管为阳性管为阳性，最高最高3管为阴性管为阴性。如无法估测样品中的菌数。如无法估测样品中的菌数时，应做一定范围的稀释度。时，应做一定范围的稀释度。 7、 MPN检索表只提供了检索表只提供了3个稀释个稀释度，若改用其它浓度时，表内数字应相应度，若改用其它浓度时，表内数字应相应增加或减少。增加

14、或减少。酱油（酱油（GB/T2717-2003）细菌菌落总数：细菌菌落总数： 30000cfu/ml大肠菌群：大肠菌群： 30MPN/100ml肠道致病菌：肠道致病菌： 不得检出不得检出全脂奶粉、脱脂奶粉（全脂奶粉、脱脂奶粉（GB5410-1999） 特级特级 一级一级 二级二级细菌菌落总数：细菌菌落总数：20000 30000 50000（cfu/ml）大肠菌群大肠菌群 40 90 90（MPN/100g）肠道致病菌：肠道致病菌： 不得检出不得检出 不得检出不得检出 不得检出不得检出巴氏杀菌乳（巴氏杀菌乳（GB5408.1-1999）细菌菌落总数：细菌菌落总数： 30000cfu/ml大肠菌群：大肠菌群： 90MPN/100ml肠道致病菌：肠道致病菌： 不得检出不得检出生活饮用水卫生标准（生活饮用水卫生标准（GB5749-2006）菌落总数菌落总数cfu/ml： 100总大肠菌群总大肠菌群cfu/100ml或或MPN/100mlMPN/100ml ：不得检出：不得检出耐热大肠菌群耐热大肠菌群cfu/100ml或或MPN