高温胁迫下拟南芥POD酶活性分析

1、高温胁迫下拟南芥过氧化物酶活性分析高温胁迫下拟南芥过氧化物酶活性分析生科院 植物生理教研室 刘太波前言 过氧化物酶（过氧化物酶（POD）是存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应。多数植物过氧化物酶与碳水化合物结合成为糖基化蛋白。糖蛋白有避免蛋白酶降解和稳定蛋白构象的作用。在正常条件下，植物体的活性氧产生与清除处于动态平衡动态平衡，不会积累过多活性氧。但当植物遭受干旱、低温、高温、盐渍、高光强、O3和SO2等逆境，以及植物衰老时（目前有人认为衰老也是一种逆境），体内活性氧产生与清除的代谢系统发生变化，严重时会失调，导致O-2、,H2O2 、OH-

2、，等活性氧在体内的过量积累，从而对植物造成伤害。逆境对植物的影响逆境对植物的影响逆境对生物的影响逆境对生物的影响高温高温逆境对植物的影响逆境对植物的影响干旱干旱而植物为保护自身免受活性氧的伤害，形成了内源保护系统，包括抗抗氧化酶类和非酶抗氧化剂氧化酶类和非酶抗氧化剂。抗氧化酶主要是超氧物歧化酶（SOD）,过氧化氢酶（CAT）,过氧化物酶（过氧化物酶（POD）,谷胱甘肽还原酶（GR）等，抗氧化剂则包括还原型谷胱甘肽（GSH）、抗坏血酸（AsA），类胡萝卜素、2生育酚和类黄酮等。测定抗氧化酶活性、抗氧化剂含量在逆境条件下的变化情况，对于研究植物的逆境伤害和植物抗逆机制，具有重要意义。植物对逆境的反

3、应植物对逆境的反应实验原理实验原理过氧化物酶过氧化物酶（POD）催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，过氧化氢可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻氧基苯酚。红棕色的物质可用分光光度计在470 nm处测定其吸光度，即可求出该酶的活性。实验材料实验材料10-d-old Arabidopsis (拟南芥)仪器设备仪器设备台式高速冷冻离心机、紫外分光光度计、1.5 mL离心管、移液器（100和1000L）、研钵、培养皿、1/2 MS培养基、高压灭菌锅、超净工作台、培养箱

4、、电子天平实验步骤实验步骤1. 配置1/2 MS培养基，121 高压灭菌20 min；2. 取野生型（WT）拟南芥种子，在超净工作台中播种到1/2 MS培养基上，播种8皿，确保能收集到6 g以上拟南芥。4 春花处理2天，之后放在光照培养箱中培养。（22，14 h 光照，10 h 黑暗的光周期下培养10 d） 以上1，2步由教师在实验课两周前准备材料。实验步骤实验步骤3. 取四皿拟南芥，置于37 培养箱中光照培养4 h，对照组的四皿仍然在22 培养箱中光照培养。4. 肉眼观察伤害症状，并记录实验现象。5. 粗酶的提取：分别称取0.05 g 材料（全苗），加入500 L pH=7.0 PBS (磷酸盐缓冲液) , 冰浴研磨，转移1.5 mL 离心管中，置于10000 rpm 4 离心10 min, 上清液即为粗酶液。实验步骤实验步骤6. POD酶活性的测定：取酶液50 L于比色杯中 ，加入2.95 mL反应液 (0.3% H2O2 1 mL； 0.2% 愈创木酚0.95 mL ； pH=7.0 PBS 1 mL)，启动反应，测定470 nm处OD值的上升速度。 以每分钟以每分钟OD值上升值上升0.01定义为定义为1个酶活力个酶活力单位。单位。测定两分钟内测定两分钟内OD470值的变化。值的变化。