PCR引物设计过程

1、PCR 引物设计过程（一）设计引物前应的准备工作：1准备载体图谱，大致准备把片断插在那个部分2对片断进行酶切分析，确定一下那些酶切位点不能用3准备一本所买公司的酶的商品目录，便于查酶的各种数据及两种酶是否可以配用（二）引物的结构： 5保护碱基+酶切位点 +引物配对区31两个酶切位点2酶切位点的保护碱基3 5端保护碱基4 3端保护碱基5引物配对区（三）设计引物所要考虑的问题1酶切位点两个酶切位点应是载体上的，所连接片断上没有这两个位点，且距离不能太近，否则往往导致两个酶都切不好。因此，两个酶切位点要紧挨在一起，只能切一个，除非恰好是与上面两个酶在一起的酶切位点，最好隔四个核苷酸。且不能有碱基的交

2、叉，比如AGATCTTAAG，这样的位点比较难切。2酶的选择最好使用双酶切效率高的，但两个酶切点最好不要是同尾酶（切下来的残基不要互补），否则效果相当于单酶切，最好使用具有共同buffer ，且较常用的酶（如hind3 ， bamh1 ，ecor1 等），这样可以省钱。3 Tm 的计算。Tm 是由互补的DNA 区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。因此，对于引物的Tm ，只有和模板互补的区域对Tm 才有贡献。计算Tm 时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。设计引物的时候，先不管 5'端的修饰序列，把互补区的Tm 控制在 55 度以上（我喜欢控制在58 以

3、上，具体根据PCR 的具体情况， 对于困难的 PCR ，需要适当提高Tm ），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。Tm温度高的引物就比较容易克服3发卡、二聚体及3' 非特异结合等问题。简单的计算公式可以用2+4的公式。 若你计算的Tm值达到了快90，不包括酶切位点。引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。自己可以再估计一下。如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29 、 33 个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为 17 、21 个碱基。 引物公司给的单子是70 多度，实际用的只有 50 度，用 55 度扩的结果也差不多。其它关于 Tm 值的计

4、算，有用 PP5.0 进行评价的，需要考虑 base number 、GC% 、 Tm 、hairpin 、dimer 、false priming 、 cross dimer 等参数。4退火温度退一般退火温度为Tm-5 度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，PCR 几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm 值低些（这样可能会增加非特异性） ，Tm 值是你包括酶切位点及保护碱基的 Primer 计算出来的。5 5端保护碱基一般在 5'端加保护碱基 ,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入 T-VECTOR 或者其它的载

5、体的话 ,酶切时可以不需加保护碱基6引物二聚体关于引物二聚体， 最好用 primer 或是其他设计引物的软件进行计算一下，看看引物之间的 G（自由能）的绝对值，如果小于 10 ，一般是问题的。如果稍大， PCR 时可以提高一下退火温度，一般是没有问题的。如果 3端形成二聚体，并且自由能绝对值较大，如果PCR 没有条带， 建议重新设计引物。此外，所加的三个核苷酸的保护序列经过尽心设计有时也可以降低二聚体的G。7引物的设计在设计酶切位点时，最好能尽可能多的利用引物本身的碱基。这是因为，一个特异性引物一般都是20bp 左右，再加上酶切位点序列和保护性碱基，大致就是 28bp 左右了。而我们在设计退火温度时， 与引物的长度有关， 比正常的引物 (20bp)的 Tm 肯定要高一些。 如果我们能利用引物自身的部分序列，就可以有效地减少引物的长度。还有，有些酶是离不开末端序列的，因此，在设计一个酶位点时，最好把该酶的性质弄清楚。设计时限制性酶切位点是应该在 5端的顶端。在设计引物时， 常在 5端添加酶切位点，以利于 PCR 产物连接到载体。设计引物时保证在最后 5 个核苷中含有 3 个 A 或 T。先用软件设计出合适的引物，引物的 3端是引发延伸的