T-A克隆操作规程

1、T-A克隆操作规程一、实验用品的查看和准备PCR模板：待测混合菌引物：sgR、sgF SP6、T7大肠杆菌JM109高敏感受态、新鲜 LB或SOB培养基酶和生化试剂：Taq DNA聚合酶、氨卞抗生素（Amp）、X-Gal、IPTG、DNA Maker DL2000 、 DNA Maker入Hind川、胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶、T-vector二、实验操作1、PCR扩增目的 DNA片段按单菌16S扩增操作规程进行混合菌16S的扩增。2、PCR产物回收按切胶操作规程进行大小为1.5KB的目的DNA片段的切取和回收，电泳验证。3、连接短暂离心载体和对照插入 DNA，使沉于管底。取新的经灭菌处

2、理的 0.5ml eppendof管，按 以下连接体系加入各种物质，胶回收产物量视电泳结果和吸光度而定，用无菌水补足体积到10此。用枪混匀后在微量离心机上将液体全部甩到管底，于14-16 C保温8-24小时或4 C过夜。16S胶回收产物X uL2X Rapid ligation buffer5.0T-Vector1.0T4 DNA ligase1.0ddH2O(3-X) uL4、转化1）、取足够量的冰制成冰盒，从-80C冰箱拿出大肠杆菌 JM109高效感受态置于冰盒中 5 min使其融化，轻轻摇晃混匀。3uL连接产物2） 、将 luL pET-28a邙日性对照）分别加到对应的感受态细胞中，轻轻

3、摇匀。什么都不加（阴性对照）3）、置于冰上放置 20 min-30 min。4）、42 C（精确）热激 90 S,不要摇动。5）、立刻置于冰上 2 min。6） 、加入950 uL SOB或LB培养基（无抗生素），阳性对照加900 uL。7) 、37C 150rpm左右摇床培养1-1.5h。在这期间取出 SOB或LB平板，其中一个 Kan抗性，其余为 Amp抗性。在酒精灯附近取 40 uL 20mg/mL X-gal和7 uL 200 mg/mL IPTG 用玻璃棒均匀的涂布在平板上。8) 、8000 rpm离心2 min，倒去大部分上清，剩余约 300 uL,洗打混匀后取 100 uL用玻璃

4、棒均匀的涂布在平板上。9) 、37 C倒置培养过夜(16 h-24 h )。10) 、每个平板上应出现约 100个菌落，置于4C最少2 h以使蓝斑颜色加深。白斑通常含插入片段，有的蓝斑也含。5、 转板：按挑菌转板操作规程将约96个白斑转到一新的平板上。6、 菌落PCR验证：除引物为 SP6、T7,其他一切按单菌16S扩增操作规程操作。7、 质粒提取验证：按SDS碱裂解法抽提质粒抽提质粒，电泳检测大小。最好加一空质粒做对照。8送测：将含有目的DNA片段的质粒送测。三、注意事项1、2X Rapid ligation buffer含有ATP,在温度波动情况下会降解，因此尽量避免多次反复冻 融。最好分

5、装成多管，一次性使用。2、目的DNA片段即使非常单一也建议做胶回收纯化，以去掉引物二聚体。3、 目的DNA片段与载体的比例尽量保持在10： 13: 1间，太少会降低连接效率，拿不到 克隆，太高浪费，也会造成非预料的连接结果。举例计算3:1时与50ng 3.0kb T载体进行连接的1.5kb的PCR产物质量：(50 ng*1.5kb ) /3.0 kb * (3/1) =75 ng4、 必要时做阳性和阴性对照。阳性对照以对照插入DNA代替PCR产物，阴性对照则不加 基因组。5、经验证，菌落PCR和质粒提取验证结果一致，可以将转板后的单菌落交由散样部提取质粒、电泳检测并测序。6、 正常情况下，阳性

6、对照会长出较多的菌落，阴性对照不会长出菌落。7、 酚氯仿异戊醇法初筛：将菌接种到1-1.5 mL液体培养基中过夜摇床培养，离心去大部分上清，留约100 uL ,加50 uL本酚氯仿异戊醇轻轻颠倒混匀，高速离心15 min，取10 uL电泳检测可初步判断菌落阴阳性。需要时可用此方法。5771001803090012095 5790368228596330825771001803090012386 5761373997357606965771001803090013594 5780775799025155125771001803090012387 5771649826018180515771001

7、803090012138 5721311921589183265771001803090012359 5790368223610760535771001803090012356 5761352861437917425771001803090012355 57508786970469327917088100343355274 10122994432583337917088100343355275 10186673293883200817088100343356107 10158115250150052217088100343356108 10100018005987173217088100343354295 10107419414268701717088100343356184 10187866086962880217088100343356185 10177583117408667417088100343356109 10108601437357284617088100343356110 10115220721601491617088100343355237 101027