β-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究

1、安 徽 农 业 大 学毕 业 论 文（设计）论文题目 -乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究 姓 名 李 晋 津 学 号 08118027 院 系 茶与食品科技学院 专 业 食品质量与安全 指导教师 薛 秀 恒 职 称 讲师 中国·合肥二一二年 六月安徽农业大学学士学位论文（设计）开题报告课题名称中性蛋白酶水解-乳球蛋白条件的研究课题来源安徽省自然科学基金学生姓名李 晋 津专业食品质量与安全学号08118027指导教师姓名薛 秀 恒职称讲师研究内容实验拟以-乳球蛋白改性及降低-乳球蛋白含量为目标，通过中性蛋白酶水解-乳球蛋白的水解条件的单因素实验及正交实验，确定出水解-乳球蛋白的最佳酶解

2、条件，并对其酶解产物进行电泳检测，检验酶解程度。研究计划第一阶段（2011/11/022011/12/02）查相关资料；第二阶段（2011/12/022012/01/20）准备试验材料做预备试验；第三阶段（2012/01/302012/03/07）做单因素和正交试验并取得相关数据；第四阶段（2012/04/102012/06/06） 整理分析数据并写论文。特色与创新 运用SAS系统统计正交实验结果得出最佳酶解条件，通过SDS-PAGE蛋白电泳证明，-乳球蛋白被酶解为小肽。指导教师意见教研室意见学院意见主要领导签名：年 月 日目 录摘要1一、引言11.1 -乳球蛋白的结构与应用11.2 -乳球蛋

3、白的致敏性及其水解改性2二、实验材料与方法42.1 实验材料42.2 试剂与仪器设备42.2.1 试剂42.2.2 主要仪器设备42.3 实验方法42.3.1 测定指标与方法42.4 试验方案的设计62.4.1 温度对-乳球蛋白水解影响的检测方法62.4.2 时间对-乳球蛋白水解影响的检测方法62.4.3 酶添加量对-乳球蛋白水解影响的检测方法62.4.4 正交实验72.4.5 电泳实验7三、 结果与分析93.1 温度对氨基酸态氮含量的影响结果93.2 时间对氨基酸态氮含量的影响结果103.3 酶添加量对氨基酸态氮含量的影响结果103.4 正交实验结果113.5 电泳检测结果13四、讨论14五

4、、结论15致谢17参考文献18Abstract20-乳球蛋白的中性蛋白酶水解作用研究作者：李晋津 指导老师：薛秀恒（安徽农业大学茶与食品科技学院 合肥230036）摘要：本实验以-乳球蛋白为原料，通过单因素与正交实验，以甲醛滴定法测定蛋白水解后氨基酸态氮含量，确定中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳温度、时间、酶添加量，以实现-乳球蛋白的改性及降解-乳球蛋白。结果表明，中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳条件为50水浴温度下，0.0079g中性蛋白酶水解40分钟；SDS-PAGE蛋白电泳显示，-乳球蛋白被酶解为小肽。关键词：中性蛋白酶；-乳球蛋白；酶解；小肽一、引言1.1 -乳球蛋白的结构与应用-乳球蛋白

5、（-lactoglobulin，-Lg）是由乳腺上皮细胞合成的特有蛋白，普遍存在于驯鹿、猪、马、羊、猫和狗等多种哺乳动物的乳汁中，但是在单峰驼和人乳中不存在或含量甚微1。牛奶中的-Lg分子质量在18 kD左右，等电点为5.3，共由162个氨基酸残基组成，含有5个半胱氨酸残基。-Lg由非共价键连接的2个单位亚基组成，每个单体含有2个二硫键（Cys66-Cys160和 Cys106-Cysl19）和一个自由巯基 （Cysl21）。-Lg在牛奶中主要以二聚体的形式存在，二聚体像一个拉长的椭圆体，长约6.95nm，宽约3.6nm2。-Lg具有紧密的三级结构，单体近似球形，它的三维结构在pH中性时，由8

6、条反平行链组成-桶状结构，有1个+1拓扑，此结构外部有1个含有3个转角的a-螺旋和9条链（A、B、C、D、E、F、G、H、I）1。A-D链形成一个面，E-H 链形成另外一个面。A链与其它3条链（B、H、I）氢键结合，A链和H链之间的结合形成-桶状结构的闭合，外面有a-螺旋保护-桶状结构3。EF链形成的结构作为结合位点的“大门”，当pH较低时，“大门”关闭，结合位点受抑制；当pH 较高时，“大门”开放，配体可以与结合位点结合。如图1-1。 图1-1 -乳球蛋白的三维结构示意图研究表明，-乳球蛋白中心形成一个疏水性结构，-乳球蛋白具有很强的结合脂溶性维生素及脂肪酸的能力，可以作为像VA、VE等脂溶

7、性营养物质的添加载体，这可用于生产无脂或低脂且富含脂溶性维生素的营养食品。目前，-乳球蛋白的应用主要是在食品工业上，由于其具有多种生物学活性，同时经蛋白酶水解后仍可得到多种生物活性肽，因此被应用于食品加工中。-Lg的热变性与牛奶加工密切相关，可以利用在不同加热条件下，-Lg含量的变化规律区分不同加工类型的牛奶。国际乳业联合会（IDF）规定巴氏杀菌乳和高温巴氏杀菌乳中可溶性-Lg的质量浓度应分别大于2600mg/L和2000mg/L，UHT乳中可溶性-Lg浓度应高于50mg/L4。因此，-Lg可以作为牛奶热加工程度的评价指标。在生奶样中添加-乳球蛋白，不仅可以增加乳清蛋白的浓度，而且还能推迟UH

8、T乳（瞬时超高温灭菌乳）的凝集时间。-Lg具有很强的脂肪酸结合力，一般作为功能性配料使用。由于-乳球蛋白对脂溶性维生素（如VA，VE等）有一定的吸附作用，可作为维生素的载体应用在食品加工中。目前，一些生产商已采用热诱导-乳球蛋白胶来模仿和替代脱脂食品中的动物脂肪5，从而作为脂肪的替代品应用在低脂食品的加工生产中。此外，-Lg固有的生物活性，如抗氧化性，可以应用于化妆品生产。1.2 -乳球蛋白的致敏性及其水解改性随着对-乳球蛋白的深入研究，发现它是婴儿牛乳过敏症的主要致敏原。据报道有0.57.5的婴儿会发生对牛乳的过敏反应，如湿疹、腹泻等6。这是由于新生儿的胃肠道通透性较强，可直接吸收-乳球蛋白

9、，从而引起婴儿的过敏反应7。因此消除牛奶中主要致敏原-乳球蛋白的致敏性仍是国际乳制品加工技术研究的热点之一。消除-乳球蛋白致敏性的主要措施是将-乳球蛋白过敏原进行降解。目前，对-乳球蛋白过敏原进行降解的方法有加热、加压、酶解、化学改性与发酵改性等，但对目的蛋白的直接酶解方法以其安全性高、工艺操作简便且便于控制等优点成为大多数研究者是首选的方法8-10。 蛋白酶是以蛋白质一级序列结构中的某一肽键为切割位点的，具有专一性与靶向性，每一种蛋白酶在蛋白表面都以不同的肽键作为靶点，如果靶点存在于-Lg过敏原表位上，在蛋白酶对蛋白质进行水解的过程中，可以靶向地切割过敏原表位的肽键，产生氨基酸，消除致敏性1

10、1。Linda利用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用水解-乳球蛋白，发现水解后的-乳球蛋白的过敏性降低，但不会完全消除12。Bernard用胰蛋白酶水解酪蛋白，发现其可以水解肽链第152位，53139位片段，用纤溶酶可以水解酪蛋白的第106209位片段这些多肽片段中包含有过敏性表位，经水解后可以使酪蛋白的过敏性降低13。也有研究者对几种酶的-Lg酶解性能进行了筛选，结果表明菠萝蛋白酶与中性蛋白酶降低了-Lg大部分的致敏性，胰凝乳蛋白酶对致敏性的消除效果较好14-15。前期的研究，大多数是以碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等进行酶解，胃蛋白酶是外肽酶，优先选择苯丙氨

11、酸或酪氨酸残基的C末端降解，特异性水解疏水链端N。外肽酶不能水解分子内肽键，分子内大量的肽键得以保存，从而不能有效提高水解度。 中性蛋白酶是内肽酶，催化蛋白水解时基团专一性较差，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺键，水解蛋白质分子内部的肽键，生成相对分子量较小的多肽。但目前对中性蛋白酶的酶解作用研究甚少，其最佳酶解条件不甚明确，因此，本实验以牛乳中主要致敏原-乳球蛋白为研究对象，通过中性蛋白酶水解作用的因素研究，确定中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳酶解条件，增强中性蛋白酶在-乳球蛋白过敏原表位上的识别靶向性，提高中性蛋白酶对-乳球蛋白的脱敏效果，降低-乳球蛋白的致敏性，这对提升乳制品的食用价

12、值具有重要意义，为-Lg 在乳品工业中的应用提供理论和实验依据。 二、实验材料与方法2.1 实验材料-乳球蛋白标准品 sigma公司生产中性蛋白酶（6000活力单位/克） 北京索莱宝科技有限公司2.2 试剂与仪器设备2.2.1 试剂NaOH 分析纯邻苯二甲酸氢钾 分析纯95%乙醇 分析纯酚酞 分析纯甲醛溶液 分析纯丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺 Beijing solarbio science& technology公司生产尿素（电泳级） biosharp公司生产Tris Base和SDS Amresco公司生产2.2.2 主要仪器设备核酸蛋白检测仪 Bibby Scientific LtdP

13、HS-3D型酸度计 金坛市盛蓝仪器制造有限公司SL202N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司EL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂DYY-6C型电泳仪 北京六一仪器厂2.3 实验方法2.3.1 测定指标与方法实验以游离氮含量为指标，用甲醛滴定法测定中性蛋白酶水解-乳球蛋白后的氨基酸态氮含量，以分析水解效果。具体方法为：吸取酶解液20mL加入烧杯中，加60mL纯水搅匀。酸度计测pH，以0.05mol/L NaOH滴定至酸度计指示计为8.2，记下消耗的NaOH溶液的体积。然后向其中加入10.0mL甲醛溶液，滴定至溶液pH为9.2，

14、记下消耗的NaOH体积。同时以80mL纯水做空白实验。记下消耗的NaOH体积V2。氨基酸态氮含量%= (公式2-1) 式中：V1实验组在甲醛滴定终点（pH9.2）所消耗的NaOH标准溶液的体积； V2空白组在甲醛滴定终点（pH9.2）所消耗的NaOH标准溶液的体积； cNaOH标准溶液的浓度，mol/L； m测定用样品溶液相当于样品的质量，g； 0.014N2的毫摩尔质量，g/mmoL。实验所需溶液配制： (1) -乳球蛋白溶液的配制：称取50mg的-乳球蛋白标准样品，加纯水溶解后，定容至50mL容量瓶中，摇匀，制成1mg/mL的稀释液置4冰箱中备用。 (2) 0.05mol/L NaOH溶液

15、配制：准确称取1.0g NaOH，用去CO2蒸馏水定容至500mL容量瓶中。盖紧胶塞，摇匀，置于广口瓶中备用。 (3) 0.05mol/L NaOH溶液的标定：称取0.36g邻苯二甲酸氢钾（105下烘干）于三角瓶中，倒入50mL去CO2水混匀。向其中加入2滴酚酞试剂。用上述所配的0.05mol/L NaOH溶液滴定至瓶内液体为粉红色，30s不褪色。记下消耗的NaOH溶液的体积V1。平行四组，结果如表2-1。做空白实验，记下消耗NaOH溶液体积V2。 计算公式：c(NaOH)= m×100/(V1-V2)×M M=204.22 (公式2-2）表2-1 邻苯二甲酸氢钾质量m与消

16、耗的NaOH体积V1称取邻苯二甲酸氢钾的质量m(g)实验组消耗NaOH体积V1(mL)0.360035.500.360335.400.360635.430.360835.45空白组消耗NaOH体积V2=0.020mL将表2-1数据带入公式求得c(NaOH)，取平均值，c(NaOH)=0.04982mol/L，说明上面所配0.05mol/L NaOH溶液符合要求。2.4 试验方案的设计 首先，选定酶解反应的单因素条件，即温度、时间、酶添加量，根据查阅资料在中性蛋白酶最适反应温度上下选定5个水平条件，如表2-2。表2-2 酶解条件单因素实验水平因素序号温度()时间(min)酶添加量(g)13030

17、0.002240600.004345900.0064501200.0085551500.0102.4.1 温度对-乳球蛋白水解影响的检测方法分别称取0.006g中性蛋白酶加入2mL配制的-乳球蛋白样液于5个试管中，标号1、2、3、4、5，调节水浴温度30、40、45、50、55，水浴30min，然后沸水浴10min。冷却后将其定容至100mL，摇匀静置。吸取20mL于烧杯中，加入60mL纯水搅匀。后按甲醛滴定法操作，记下pH9.2时消耗的NaOH的体积V1 。2.4.2 时间对-乳球蛋白水解影响的检测方法分别称取0.006g中性蛋白酶加入2mL配制的-乳球蛋白样液于5个试管中，分

18、别标号1、2、3、4、5，调节水浴温度为45，分别水浴30min、60min、90min、120min、150min，然后沸水浴10min。冷却后将其定容至100mL，摇匀静置。吸取20mL于烧杯中，加入60mL纯水。后按甲醛滴定法操作，记下pH9.2时消耗的NaOH的体积V1 。2.4.3 酶添加量对-乳球蛋白水解影响的检测方法分别称取0.002g、0.004g、0.006g、0.008g、0.010g中性蛋白酶，加入2mL配制的-乳球蛋白样液于5个试管中，分别标号1、2、3、4、5，45条件下水浴30min，然后沸水浴10min。冷却后将其定容至100mL，摇匀静置。吸取20

19、mL于烧杯中，加入60mL纯水。后按甲醛滴定法操作，记下pH9.2时消耗的NaOH的体积V1。2.4.4 正交实验在上述单因素水平实验基础上，取水解温度、时间、酶添加量为考察因素，各取三个水平，用L9(33)正交表进行实验，以氨基酸游离态氮为指标，选出最佳方案。因素水平见表2-3。表2-3 酶解条件正交实验因素水平序号温度() 时间(min) 酶添加量(g)140 20 0.004245 30 0.006350 40 0.0082.4.5 电泳实验聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是分离蛋白质的常用生化方法，样品的蛋白质分子热变性解聚后与SDS结合形成带负电的蛋白质-SDS复

20、合物，复合物在电泳中的迁移率取决于蛋白质的分子大小，使用均匀浓度的SDS-PAGE来分析分子量在15200kDa的蛋白质时，电泳迁移率与分子量的对数成线性关系。本实验采用Tricine-SDS-PAGE方法进行电泳实验。首先配制储存液及缓冲液：(1) 3C丙烯酰胺储存液：将48g丙烯酰胺和1.5g甲叉双丙烯酰胺溶于重蒸水中至100mL。(2) 5C丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解47g丙烯酰胺和2.5g甲叉双丙烯酰胺成100mL溶液。(3) 6C丙烯酰胺储存液：用重蒸水溶解46.5g丙烯酰胺和3.0g甲又双丙烯酰胺成100mL溶液。(4) 正极缓冲液(10×)：121.14g Tris溶

21、于400ml重蒸水，用1.0molL HC1调至pH8.9，定容至500ml。(5) 负极缓冲液(10×)：将60.55g Tris，89.58g Tficine及5g SDS溶于400ml重蒸水中，加水至终体积为500ml。(6) 凝胶缓冲液的配制：将181.5g Tris，1.5g SDS溶于400ml重蒸水中，用1mol/L HCl滴定至pH8.45，再加水稀释至500mL。尿素（U）能增强分离效果，致密胶可配成6C+U、5C+U、5C，但经研究5C+U制成的聚丙烯酰胺凝胶对特小分子量的蛋白标准品分离效果最好16，故本实验采用5C+U的丙烯酰胺溶液制胶。见表2-4。表2-4 5

22、C+U丙烯酰胺溶液配制组分浓缩胶夹层胶致密胶(5C+U)凝胶缓冲液(3X)0.6mL0.5mL1mL3C凝胶储存液0.125mL0.5mL/5C凝胶储存液/1mL尿素/1.08g加水至1.8mL1.5mL3mL操作步骤如下： (1) 灌胶：凝胶制作采用三层不连续胶的结构，由致密胶、夹层胶、浓缩胶构成。每层胶分别加入10L的过硫酸铵和2L的TEMED加速凝胶凝固，然后灌胶，先灌下层的致密胶，再覆以中间的夹层胶，然后铺浓缩胶。静置以形成不连续的梯度凝胶。 (2) 点样：取10L的蛋白质标准品，煮沸5min使蛋白质与SDS结合变性，小心点入凝胶的点样孔中。 (3) 电泳：内槽加入负极电泳缓冲液，外槽

23、加入正极电泳缓冲液，形成Trcine-SDS-PAGE电泳系统，以恒定电压电泳2h（浓缩胶、夹层胶恒定电压30V，致密胶恒定电压100V）。(4) 考马斯亮蓝染色：戴上手套将胶移入一个盛有约20mL考马斯亮蓝染液的容器内，在摇床上缓慢震荡10-20min。(5) 脱色：弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。加入约50mL的考马斯亮蓝脱色液，脱色1h。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。3、 结果与分析3.1 温度对氨基酸态氮含量的影响结果图3-1 温度对氨基酸态氮含量的影响由图3-1可知在研究温度因素时，在3045范围内，氨基酸态氮含量随温度的升高而增加，在45时水解效果最佳，氨基酸态氮含量达

24、到了31.5%。之后随着温度上升，氨基酸态氮含量反而下降。由此我们可以得出，中性蛋白酶只有在一定的温度范围内才能保持对乳清蛋白较高的水解活性，温度过高过低都会对其水解能力产生重要影响，故我们选择45为最佳酶解温度。出现这种现象的原因可能是当开始温度较低时，酶的活性及水解效果随温度的升高而增加，-乳球蛋白的水解效果也不断增大。当温度持续升高到超过酶的耐受温度一定值时，水解的增大已不能补偿酶失活对水解造成的负影响，此时乳清蛋白的水解度下降17-18。因此研究单因素温度时，我们选择45为最佳酶解温度。3.2 时间对氨基酸态氮含量的影响结果图3-2 反应时间对氨基酸态氮含量的影响由图3-2可以看出酶解

25、时间30分钟时，水解后氨基酸态氮含量最高，达到了31.5%，之后随着反应时间的延长，水解后的氨基酸态氮含量逐渐下降且趋于平稳，氨基酸态氮含量变化不大。分析原因可能是由于酶解时间延长，使得酶活性降低或失活。故实验结果显示水解30分钟酶解效果最好。而有研究以木瓜蛋白酶组合、中性蛋白酶组合进行-乳球蛋白的酶解试验，结果显示在120min之内，水解效果变化不大。因此，本试验选择最短的30分钟作为-乳球蛋白的降解时间19。3.3 酶添加量对氨基酸态氮含量的影响结果图3-3 酶添加量对氨基酸态氮含量的影响由图3-3可看出，在酶添加量0.0020.006时，随着酶量的增加，水解后氨基酸态氮含量不断增加，水解

26、效果增强。当中性蛋白酶添加0.006g时酶解效果最好，氨基酸态氮含量达到了37.62%。此后，继续增加酶量，氨基酸态氮含量下降，酶解效果变差。说明在酶添加量大于0.006g时，-乳球蛋白始终处于过饱和，水解过程中，酶浓度的增大并未明显增大水解反应速度，继续增加酶量，游离氨基酸态氮含量变化不大，逐渐趋于平稳。3.4 正交实验结果表3-1 酶解条件的正交实验结果实验号温度()时间(min)酶添加量(g)氨基酸态氮含量%140200.00435.00240300.00614.00340400.00831.85445200.00634.13545300.00828.88645400.00439.387

27、50200.00841.65850300.00427.13950400.00646.38运用SAS系统分析表3-1数据，得到酶解条件最优组合10个如下表3-2：表3-2 SAS系统统计结果 序号X1X2X3Y150400.00790.530636913249.8400.00790.5279286862349.6400.00790.5251532058449.4400.00790.5223104718549.2400.00790.519400484265039.60.00790.516540913749400.00790.516423243850400.00760.515121612949.83

28、9.60.00790.51391428621049.8400.00790.5133787482注：X1、X2、X3分别代表温度、时间、酶添加量，Y代表氨基酸态氮含量运行SAS系统分析如图3-4-1、3-4-2：Y：游离氮 X1：温度 X2：时间图3-4-1 温度与时间的交互作用影响 由图3-4-1可看出，时间为主导因素。就温度这一因素看来，氨基酸态氮含量随着温度的升高而增大，在50时达到最高。就时间因素来看，氨基酸态氮含量最低点大概在30分钟左右，当反应时间小于30分钟时，氨基酸态氮含量随时间的延长而降低。当反应时间大于30分钟时，氨基酸态氮含量随反应时间的延长而增大，在40分钟时含量达到最大

29、。Y：游离氮 X1：温度 X3:酶添加量图3-4-2 SAS系统运行结果图由图3-4-2可以看出在分析温度与酶添加量交互作用时，温度起主导作用，氨基酸态氮含量随温度变化趋势较大，且随着温度的升高而增加，在50时含量最高，达到50%以上。就酶添加量而言，氨基酸态氮含量随酶添加量增减变化不大，相对较低点在酶添加量0.006g左右，添加0.0079g酶时氨基酸态氮含量最大，故最佳酶添加量为0.0079g。以上两个图分析得知在温度与时间的交互作用中，总体上氨基酸态氮含量随温度升高而增大，50时含量最大，相较而言时间起主导作用，反应时间小于30分钟时氨基酸态氮含量随时间延长而降低，大于30分钟时情况则相

30、反，故选择氨基酸态氮含量达最高值：即反应时间40分钟为最佳酶解时间。温度与酶添加量相互作用分析时，温度为主导作用，氨基酸态氮含量随温度升高而增大，50时最大。氨基酸态氮含量随酶添加量增减变化不大，添加0.0079g酶时氨基酸态氮含量最大高。而时间与酶添加量之间无相互作用，说明这两个条件的交互作用对酶解反应无影响。故通过SAS系统分析，得出中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳酶解条件为50条件下，0.0079g中性蛋白酶水解40min。3.5 电泳检测结果 图3-5 中性蛋白酶酶解-乳球蛋白电泳图Marker:超低分子量蛋白 L:中性蛋白酶解产物 本文采用“5C+U”丙烯酰胺溶液配成的聚丙烯酰胺凝胶，

31、使丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度为5.05，分离超低分子量蛋白标准品Marker，可见清晰的5条带，其分子量依次为为图3-5中所标3.3kD-20.1kD。图3-5中根据-乳球蛋白的电泳染色带的迁移率与超低分子量蛋白Marker迁移率的对比，可以得出-乳球蛋白分子量范围在14.4-20.1kD之间。L为中性蛋白酶解产物电泳条带，图中显示中性蛋白酶分子量在35-40kD之间，由此得出上面一条带为中性蛋白酶电泳条带，下面一条带说明中性蛋白酶水解-乳球蛋白内部的肽键，生成约为10kD的小肽，条带较清晰。四、讨论蛋白酶是以蛋白质一级序列结构中的某一肽键为切割位点的酶，每一种蛋白酶都有各自不同的专一性

32、。在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸。关于-乳球蛋白的酶解，重点主要是降低蛋白的过敏性和改善其营养和功能特性。-乳球蛋白是一种抗酶解性较强的蛋白质，一般蛋白酶对其的水解度都在20%左右。Lametti等运用胰蛋白酶或胰凝乳酶分别在55、60、65，中性pH条件下，对牛乳-乳球蛋白进行水解，该研究从-乳球蛋白的结构变化机理上阐明了水解物的低过敏性是因为-乳球蛋白经过酶水解，其中的大多数引起抗原性因子的消失，从而降低了其免疫反应性20。因此，选择合理的酶、有效控制酶解条件及酶解过程仍是酶法改性的关键。碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等

33、目前都能够达到工业化生产，但是碱性蛋白酶是众多常见蛋白酶中水解-乳球蛋白效果最好的，单酶水解度可以达到30%左右。碱性蛋白酶是微生物酶，来源广泛、活力比较高，它是肽链内切酶，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺键，水解蛋白质分子内部的肽键，能从肽链的内部将肽链切断，生成中等分子量的肽，再进而对这些肽进行水解生成更小的分子。木瓜蛋白酶对-乳球蛋白的水解最迅速。在加入木瓜蛋白酶后，所有亚基均被迅速降解为小分子肽，这可能是因为木瓜蛋白酶是巯基蛋白酶，而巯基蛋白酶具有较宽的底物特异性，因此几乎对所有亚基都有作用。胃蛋白酶是外肽酶，优先选择苯丙氨酸或酪氨酸残基的C末端降解，特异性水解疏水链端N。外肽酶

34、不能水解分子内肽键，分子内大量的肽键得以保存，从而不能有效提高水解度。本实验主要研究中性蛋白酶单酶水解-乳球蛋白的条件。单因素实验中，研究温度这一因素时，可看出，温度对氨基酸态氮含量的影响图为抛物线式，酶解效果在45时最好，温度或低或高都会降低酶解效果；反应时间为影响因素时，酶解时间30分钟后，水解后氨基酸态氮含量最高，达到了31.5%，之后随着反应时间的延长，水解后的氨基酸态氮含量逐渐下降且趋于平稳，氨基酸态氮含量变化不大。分析原因可能是由于酶解时间延长，使得酶活性降低或失活。故实验结果显示水解30分钟酶解效果最好；再看酶添加量这一影响因素，在添加0.006g中性蛋白酶时，酶解效果最好，氨基

35、酸态氮含量达到了37.62%。正交实验结果显示温度与时间之间，温度与酶添加量之间有相互作用，对酶解效果有影响，而时间与酶添加量之间无相互作用，说明这两个条件的交互作用对酶解反应无影响。通过SAS系统分析，得出中性蛋白酶水解-乳球蛋白的最佳酶解条件为50条件下，0.0079g中性蛋白酶水解40min。高学飞（2006）研究表明，中性蛋白酶水解乳清蛋白的最佳条件参数为温度为50，初始pH值为7.5，加酶量8000u/g蛋白，乳清蛋白浓度为6%。这与本实验结果基本一致17-18。本实验研究的是中性蛋白酶对-乳球蛋白的水解作用，中性蛋白酶是内肽酶，催化蛋白水解时基团专一性较差，主要催化由疏水性氨基酸的

36、羧基形成的酰胺键，水解蛋白质分子内部的肽键，生成相对分子量较小的多肽，从而降低-乳球蛋白的致敏性，但这给电泳检测带来困难。Tricine-SDS-PAGE中Tricine以阳离子形式存在可以作为拖尾离子，使小分子多肽能够在浓缩胶中形成尽可能窄的带可以提高分子质量小于20kD蛋白质的分辨率，但对于小于10kD的分辨率不佳。为解决此问题，通常会向分离胶溶液中加入甘油或尿素增加丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的交联度，以增加小分子多肽电泳分离效果。本实验采用的是添加尿素的方法，尿素可以有效地减少多肽与SDS的结合量，使得电泳谱带随着尿素和SDS的浓度改变，而且尿素的溶解性较好，化学性质受实验温度变化的影响较

37、小，有效地避免了由于电泳时间过长而使-乳球蛋白酶解液谱带弥散现象的发生。分子质量小于10kD的肽类都能可以得到较好的效果。五、结论通过SAS系统分析正交实验结果，中性蛋白酶水解-乳球蛋白过程中，在50温度条件下，添加0.0079g中性蛋白酶水解40min，酶解效果最好，酶解后可溶性氨基酸态氮含量得到显著提高，达到40%以上。建立了适合于分析-乳球蛋白酶解液的Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳。本文采用“5C+U”丙烯酰胺溶液配成的聚丙烯酰胺凝胶。电泳结果表明-乳球蛋白分子量在14.4-20.1kD之间，符合其分子量18kD。L为中性蛋白酶酶解产物电泳条带，中性蛋白酶分子量在35-40kD

38、之间，电泳后-乳球蛋白酶解为约10kD左右的小肽。致谢时光匆匆如流水，转眼便是大学毕业时节，春梦秋云，聚散真容易。离校日期日趋临近，毕业论文的完成也随之进入了尾声。从开始进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开老师、同学、朋友给我热心的帮助，在这里请你们接受我最真诚的谢意！ 本学位论文是在我的指导老师薛秀恒老师的细心指导和耐心帮助下完成的，薛老师是一个知识渊博、和蔼可亲的人，从课题的选择到论文的最终完成，薛老师始终都给予了我极大的信心与帮助，细心解答我的疑问。在此，我衷心的感谢薛老师对我的指导与帮助。其次，我要谢谢我的学长孙茂忠和徐洪军。在实验过程中，他们认真的帮助我解决困难，操作中出现问题时积

39、极的协助我克服，并在论文写作中给与我宝贵意见；王欢等学姐教我溶剂的准确标定，及SAS系统分析，让我了解了更多专业知识，学习了更多操作方法。我只能说，谢谢，谢谢你们的热情与帮助，我会更加努力。四年的大学生活真的即将结束了，安徽，这片宁静的热土，在我心里将永远保留着一份特殊的感情，亲爱的老师、同学们，我只想说一句：谢谢你们！参考文献：1 Kontopidis G, Holt C, Sawyer L. Invited review: Beta-lactoglobulin: Bindingproperties, structure, and functionJ. Dairy Sci, 2004, 87

40、(4): 785-7962 高学飞，王志耕. -乳球蛋白应用研究进展J. 乳品工业，2005，5：41-443 李兰会，孙丰梅. -乳球蛋白的热变性聚集概述J. 中国乳品工业，2002，30（6）：22-244 Mor T L, Braekman A , Car Tuyvels D, et a1. Instrinsic indicators for monitoring heat damage of consumption milkJ. Biotechnol Agron Soc Environ, 2000, 4(4): 221-2255 Lee N. Y, Cheng J. T, Enomot

41、o T, et a1. Essential of proline and valine residues in the peptide derivedfrom laetoferrin for angiotensin converting enzyme inhibitionJ.Chin Chem Soc-Talp, 2006, 53(3): 515-5186 Katou H, Hoshino M, Kamikubo H, et a1. Nativelike beta-hairpin retained in the cold-denatured state of bovine beta-lacto

42、globulinJ.Mol Boil, 2001, 310(2): 471-4847 李兰会，黄娟. -乳球蛋白的热变性聚集概述J. 中国乳品工业，2002，30（6）：22-248 Farrell HM, Jimenez-Flores JM, Bleck GT, et al. Nomenclature of the proteins of cowmilk- sixth revision J. Journal of Dairy Science, 2004, 6(87): 1641-16749 Dereck EWC,Geoffrey S,Peter R, et al.Bioactivity of

43、 -Lactoglobulin and -alctalbumin -Technological Implications for ProcessingJ.International Dairy Journal, 2006(16), 1229-124010 Chicón R, Belloque J, Alonso E, et al. Hydrolysis under high hydrostatic pressure as a means to reduce the binding of beta-lactoglobulin to immunoglobulin E from human

44、 seraJ. J Food Prot. 2008 , 71(7): 1453-145911 Gauthier SF, Pouliot Y. Functional and Biological Properties of Peptides Obtained by Enzymatic Hydrolysis of Whey ProteinsJ. J. Dairy Sci. 2003 86: 788712 Linda M, Virqinie T, Arjon J. et al. Combinations of common chronic paediatric diseases deviate th

45、e immune response in diverging directionsJ. Clin Exp Immunol. 2006 Dec; 146(3): 433-44213 Bernard H, Negroni L, Chatel J M, et al. Molecular basis of IgE cross-reactivity between human beta-casein and bovine beta-casein, a major allergen of milk.J. Mol Immunol, 2000, 37(3): 161-16714 Nilsson L, Kivl

46、ing A, Jalmelid M,et al. Combinations of common chronic paediatric diseases deviate the immune response in diverging directionsJ. Clin Exp Immunol. 2006, 146(3): 433-44215 Chicón R, López-Fandiño R, Alonso E, et al. Proteolytic pattern, antigenicity, and serum immunoglobulin E binding of beta-lactoglobulin hyd