免疫印迹-091208

1、 Western blotting 操作规程（供参考）Western blotting(2007.7)1、 洗净玻板，与胶接触的一面倾斜朝下晾干。放入电泳橡胶套内卡好(有框为高;平面为低）2、 封板： （配胶全过程须戴手套和口罩，被有毒物质污染的手套必须丢弃！)1%琼脂糖(微波加热, 液体刚沸腾即可)全溶后用枪将电泳橡胶套底部封好（两面）一块胶约24ml 琼脂糖0.5 g，加水至50ml 将其装入电泳槽内，玻璃板高的一边通正极（红色钮） 蛋白从负极向正极跑3、 分离胶：配胶（附后），一般分子量大的按10%配(or 8%)，分子量小的按12%配，10%的过硫酸铵现用现配，10%的SDS加热溶解后

2、再用 15-20 ml/板4、 将电泳槽倾斜，将上述分离胶注入至离上样梳约1cm，并在上面加2-3mm 高的异丙醇约500 ul/板，目的防止氧气扩散进入凝胶而抑止聚合反应 5、 约30min后凝固，倒出异丙醇，并用去离子水冲洗10次，再用滤纸轻轻吸出残余的水 长时间(2-3h)有利于胶结构形成，因为肉眼看胶凝时，胶内部分子的排列尚未完成6、 基层胶：基层胶的配制（附后，室温时胶凝聚比较快，夏天约需5 min，5-6ml/板) 将剩下的基层胶放置冰水中可延缓胶凝聚 基层胶如果收缩应及时补胶7、 插上上样梳(必需是干净干燥的，倾斜插入以排气泡)，注意上样梳的下沿要距离分离胶约1cm8、 待基层胶

3、凝固后往电泳槽倒入满电泳缓冲液一槽二槽三槽四槽五槽5×电泳缓冲液 160ml320ml480ml640ml800mlddH2O640ml1280ml1920ml2560ml3200ml9、倒入电泳液后缓慢拔出上样梳 凝聚的胶与不凝聚的胶有不同的折光率，故可分辨 拔上样梳后若胶齿弯曲，用9#注射针头将其扶直10、上样：收细胞：1、培养液倒入离心筒，胰酶消化细胞，也倒入离心筒，2500-3000 r/min, 10 min， 倒掉上清液2、1ml PBS重悬细胞转移至1.5 ml EP管，2500-3000 r/min, 10 min;大枪头吸弃上清液3、2500-3000 r/min,

4、 2-3 min , 小枪头吸弃上清液。-80冻存 裂解： 1、每管细胞加60-100 ml裂解液，于4冰箱内冰浴1 h2、12,000 r/min离心10-15 min，用枪头吸出上清至0.5 ml EP管3、加5×上样缓冲液，沸水浴3-5 min。-20或-80冻存方法：每个泳道加15-20 ml的样品(约30-100 mg，每个泳道上样量必须一致)。 Marker(4-6 ml)加在第一个泳道或合适的泳道。（如果是新的Marker,则每瓶加200 ml 5×上样缓冲液，分装放于-20保存） 加的样品不要溢出胶齿上部11、 通电：基层胶的电压U=7585V （80V）

5、时间约0.5-1h 检查电泳是否漏液！12、 换电压：当跑到分离胶时，电压调到180V， 时间约为3-4h13、 转膜：待蛋白的前沿(溴酚蓝)跑到接近胶底1cm或合适的位置时停止如果要检测的蛋白的分子量较小，则前沿可以不太接近底部，反之，则前沿尽量接近底部1. 将胶从电泳槽中取出，首先用手术刀柄轻轻掀起玻璃板，然后用玻璃板割去基层胶。在分离胶左下部切除一角以标注凝胶的方位2. 轻轻取出分离胶，放入已配好的转移缓冲液中3. 在转移缓冲液中量出胶的长、宽胶在含甲醇的转移缓冲液中会收缩2-3mm4. 剪硝酸纤维素膜（一块胶一张）和滤纸（一块胶6张）膜与胶形状相等，滤纸比胶少小2-3mm，否则转膜时易

6、短路5. 将3张滤纸和膜都泡在转移缓冲液中，充分浸润6. 待浸润后，先在板上放3张滤纸，用玻棒轻推滤纸以赶走气泡，然后轻轻放上胶，用玻棒轻推胶以赶走气泡胶的底部（溴酚蓝条带）朝向自己、将胶反转使胶左下角成为右下角7. 在胶上面放好硝酸纤维素膜，再放上另外3张滤纸，该过程也需要赶气泡 膜右下角剪脚以示位置，染色后反转即是电泳上样顺序8. 放入槽内并倒入缓冲液（膜朝里，即正极）转移缓冲液的配制： 一槽二槽三槽一槽二槽三槽Tris Base3.64g7.28g10.92g3.36g6.73g10.08g甘氨酸17.3g 34.6g5.19g14.42g28.82g43.26g甲醇240ml 480m

7、l720ml200ml400ml600ml去离子水960ml 1920ml2880ml800ml1600ml2400mlTotal1200ml2400ml3600ml1000ml2000ml3000ml12、 采用恒流100mA 转膜3h(大分子5h)原：转移时电压是25v,过夜13、 加丽春红染色：1. 将转膜后的聚硝酸纤维素薄膜取出，放入已配好丽春红染色缸中，染色5min2. 待出现条带后，放入去离子水中浸泡，洗去染料，并按Marker显示的位置，按分子量大小剪成一个个条带14、 封闭：将封闭液均匀涂在剪下的蛋白条带上，室温摇床缓慢振荡封闭2h以上 封闭液；脱脂奶粉 5%（V/V）0.5g

8、1.5g2.5g0.02% 叠氮钠0.002g0.006g0.01g1× PBS10ml30ml50ml15、 加一抗：把含一抗的封闭液滴在塑板上，将条带从封闭液取出，滤纸贴角吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，在反应体系外罩一湿润平皿以防止溶液蒸发孵一抗通常4度过夜 通常40ul-50ul/cm2一抗溶液加入叠氮钠，可在4存放至少2周16、 加二抗：1. 洗一抗：先用PBS洗3次，10min/次，并在摇床上振摇再用Tris-NaCl (PH 7.5)洗1次，10min/次2. 涂二抗：根据一抗的来源选择合适的二抗，按相应的比例稀释，室温孵育2h二抗的配制方法： 脱脂奶粉 5

9、%（V/V）0.25g0.5gTris-NaCl(PH 7.5) 5ml10ml二抗 稀释300-500倍17、 显色（本方法为DAB法，现多用ECL法）A、二抗孵育2-3h后（室温），用Tris-NaCl洗3次，10min/次，并振摇 B、加底物，显色5min 底物的配制：Tris-HCl (0.01M，PH 7.6) 9ml27ml45ml二氨基联苯胺(DAB，现用现配)6mg18mg30mg0.3%氯化钴1ml3ml5ml总10ml30ml50ml注：临显色前再加入二氨基联苯胺和CoCl2,还有30%的H2O2 10ml/10ml底物液（10ml加10mlH2O2），放入后快速显色，一旦

10、有清晰蛋白带出现立即拿出放在装有蒸馏水的平皿中终止生色反应 蛋白分子量 （仅供参考，详细请查阅说明书）Maker蛋 白分子量(KD)蛋 白分子量(KD)ATM236EGFR170TrkB145PLCr2140iNOS130-140SIRT1120PARP116(全长)/85/2597KDRaf76、72-76IRAK180COX-272-74COX-17066KDAkt60BECN60Caspase-855(前体)/43/42/20Cyclin B155JNK1/JNK254/46P-cdc25c55P5353Fas48 (20ug/ml)Enolase48Caspase-947(前体)/37

11、/35Actin4645KDICAD(DFF45)45/35Caspase-145(前体)/20/10ERK1/ERK242/44Caspase-7FasL38P3838IKB-a35-37P-cdc2P3434Caspase-332(前体)/17/11Bck-xl3230KDBak30FADD30BDNF30(前体)/14Bcl-226Bax23Bad23Ras21P212120KDCyto c15LC31514KDWestern blotting试剂准备1. 30%聚丙烯酰胺液： 丙烯酰胺（Acr）290 g亚甲双丙烯酰胺（Bis）10 g加ddH2O定容至1000ml，棕色瓶4保存 神经

12、毒性，可通过皮肤吸收和呼吸道进入体内，操作时戴手套和口罩2. 4×分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-Hcl PH 8.8）Tris 181.71 g加ddH2O定容至1000ml ，浓盐酸精确调至PH 8.8，4&室温保存3. 4×浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-Hcl PH 6. 8）Tris121.14 g加ddH2O定容至1000ml，浓盐酸精确调至PH 6. 8，4&室温保存4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O定容至100ml。室温保存5. 5×电泳缓冲液 Tris15.1 g甘氨酸 94 g 10%

13、电泳级SDS50ml先在水中加入Tris碱，再加甘氨酸，最后加SDS，加水至1000ml，4保存 6. 10%过硫酸铵（AP）： AP0.1 g加ddH2O至1.0ml，-20保存，一周内使用，最好新鲜配制。7. 5×上样缓冲液： 1mol/L Tris-Hcl (PH 6.8)0.6 ml50% 甘油 5 ml10% SDS2 ml-巯基乙醇 0.5 ml1% 溴芬蓝 1 ml总10ml，置4避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前使用，4保存 强神经毒性，戴口罩以防止误吸，操作时快速，存放时密封9. 转移缓冲液：PH8.3-8.4Tris3.64

14、g甘氨酸17.3 g甲醇240 mlddH2O960 ml10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ： NaCl8.0 gKCl0.2 gNa2HPO4 12H2O1.54 gKH2PO40.2 g加ddH2O定容至1000ml，调PH7.2-7.4，室温保存11. 封闭液； 脱脂奶粉 5%（V/V）0.5 g0.02% 叠氮钠0.002 g1× PBS10 ml叠氮钠毒性大，可阻断细胞色素电子运送系统，操作时戴手套12.Tris-NaCl(PH7.5)Tris12.114 gNaCl17.532 g加ddH2O至2000ml,用浓盐酸精确调至PH7.5，室温保存13.

15、 Tris-HCl(0.01M，PH7.6)Tris1.21 g加ddH2O至1000ml,用浓盐酸精确调至PH7.6，室温保存14丽春红储备液(2%):丽春红S2 g三氯乙酸30 g磺基水杨酸30 gddH2O100 ml丽春红工作液(0.2%)：室温保存2% 丽春红储备液一份ddH2O九份15生色液：联苯胺显色液（DAB）Tris-HCl (0.01M，PH7.6) 9 ml二氨基联苯胺(DAB，现用现配)6 mg0.3%氯化钴1 ml总10 ml以每10ml生色液加入10ul 30%的过氧化氢16细胞裂解液100ml： 50mmol/L HEPES (238.3) （pH7.4）1.19

16、15 g1%Triton-X100 1 ml100mmol/L NaF (44)440 mg1mmol/L EDTA (372.24)37.24 mg1mmol/L EGTA (380.40)38.40 mg加ddH2O定容至100ml， 4保存1M 500×正矾酸钠(400.12)储备液正矾酸钠(400.12)80 mgddH2O200 ml配成储备液-20保存裂解细胞时每ml裂解液加2ul储备液, 正矾酸钠终浓度为2 mmol/L0.5M（500×）储备液PMSF(174.2)17.4 mg异丙醇200 ml配成储备液-20保存裂解细胞时每ml裂解液加2ml储备液, 正

17、矾酸钠终浓度为1mmol/L使用前加入10ug/ml蛋白消化酶抑制剂aprotinin, leupeptin（储备液500mg/ml）和pepstatinA;Aprotinin:为一58氨基碱性多肽，经反复冻融后，会发生集聚，储存液应分装成小份，保存于-20度，每一小份用后应予废弃。PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。PMSF通常配成10mmol/L浓度储液（1.74或17.4mg/ml溶于异丙醇中）保存于-20度。由于蛋白抑制剂可影响蛋白定量， 且新鲜的蛋白很少降解，故可不加蛋白抑制

18、剂SDS-PAGE凝胶的有效分离范围丙烯酰胺浓度（%）1512107.55.0线性分离范围12-43 kDa14- kDa16-68 kDa36-94 kDa57-212 kDa蛋白质电泳应用抗体AntibodiesType of IgGDilutionBcl-2mouse monoclonal IgG1: 200Bcl-XLrabbit polyclonal IgG1: 500Baxrabbit polyclonal IgG1: 800ERK1/2rabbit polyclonal IgG1: 1000phospho-ERK1/2mouse monoclonal IgG1: 1000p38r

19、abbit polyclonal IgG1: 300phospho-p38rabbit polyclonal IgG1: 200JNK1/2rabbit polyclonal IgG1: 400phospho-JNKmouse monoclonal IgG1: 200caspse-3rabbit polyclonal IgG1: 200p53mouse monoclonal IgG1: 300phospho-p53 (ser15)rabbit polyclonal IgG1: 300PARPrabbit polyclonal IgG1: 500ICADrabbit polyclonal IgG1: 800secondary antibodygoat anti-rabbit IgG-HRP1: