人白介素18(IL18)RGD模体抗黑色素瘤

1、人白介素18(IL18)RGD模体抗黑色素瘤细胞B16活性研究卢忠民赵宝昌*（大连医科大学 生物化学和分子生物学教研室大连116027）摘要利用定点突变及DNA重组技术，在人白细胞介素18(IL18)的cDNA序列中插入了GGC序列，使IL18第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基，从而构建了RGD模体。此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K，并转化Pichia Pastoris酵母GS115，利用表达系统进行了高效表达。用Sephadex G100凝胶过滤纯化表达产物，获得初步纯化的蛋白。研究表明，IL18在体外对黑色素瘤细胞株B16没有作用，而IL18RGD抑制

2、作用明显，IC50 = 810mol/L；应用小鼠动物模型研究结果显示，IL18及IL18RGD均对黑色素瘤细胞B16有抑制作用，且IL18RGD比IL18的作用强；同时,对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管生成的抑制实验发现， IL18RGD 对CAM血管生成的抑制作用也比IL18强。但IL18RGD仍保存对PBMC诱导产生IFN能力。结果提示，IL18RGD在具有抗炎，抗感染作用的同时增添了抑制肿瘤血管新的功能。关键词IL18RGD模体毕赤酵母B16细胞中图分类号Q5184收稿日期：20050125修回日期：20051222* 通

3、讯作者，电子信箱：zhaobc991995年,Okamura等1首次在Nature上报道了IL18，该种因子具有强烈的IFN诱生能力，继而研究发现它具有多种生物学功能2。IL18的产生具有多源性，体内多种细胞均可产生IL18，例如NK细胞、Th1细胞、皮肤胶质细胞、活化的巨噬细胞和B细胞等。IL18还具有增强NK和CTL细胞活性、促进T细胞增殖、诱发Th1、Th2类细胞因子产生，促进免疫细胞表达FasL、增强Fas介导的细胞毒作用13。 国内张国荣等4应用动物模型研究证实IL18具有较强抑制实体瘤生长的能力； Hiroshi 等5将IL18的基因转入B16黑色素瘤内进行表达明显抑制肿瘤细胞的生

4、长。上述结果说明 IL18在抗肿瘤、抗感染方面具有潜在的应用价值。RGD肽是一类含有ArgGlyAsp序列的肽类，关于RGD肽的研究已从抗血小板聚集作用侧重到抑制肿瘤细胞粘附、抗肿瘤细胞转移和抗肿瘤新血管生成等方面，干扰肿瘤细胞的侵袭、迁移过程。鉴于此，我们对IL18进行改造，构建了RGD模体，以增加其抗肿瘤血管新生的生物活性。1材料与方法1.1材料 1.1.1菌株和质粒大肠杆菌DH5、毕赤甲基营养酵母GS115、pPIC9K酵母表达载体、重组人IL18 cDNA均由本实验室保存，pPIC9KIL18由本实验室构建。1.1.2细胞株及实验动物来源B16黑色素瘤细胞购自中国科学院上海细胞库,DM

5、EM细胞培养液购自GIBCO BRL，C57BL/6小鼠购自大连医科大学实验动物中心。1.1.3主要试剂限制性内切核酸酶、Taq聚合酶、T4 DNA连接酶、PCR Fragment Recovery Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit、MiniBEST Plasmid Purification Kit均购自大连宝生物工程有限公司；鼠抗人IFN单克隆抗体、ConA购自Sigma公司；Sephadex G100购自Amersham Pharmacia Biotech公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG为华美生物高科技有限公司产品；IFN标准品为上海克隆生物

6、高技术有限公司产品；ADP为Amresco产品；碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）购自PEPROTECH EC LTD；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Amresco产品, 其他试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1IL18RGD的构建SOE引入位点特异突变，应用重叠延伸剪接法(splicing by overlap extension, SOE)引入位点特异突变来构建IL18 RGD模体的特有碱基序列，4条引物分别为：a:5GCACAAATAACGGGTTATTG3；b:5GACTGACACCGCTATTACGTGGGGCC3；c:5

7、GGCGATAATGCACCCCGGACCAT3；d:5ATGCGGCCGGTCTTCGTTTTGAACAGTG3。首先，用质粒提取试剂盒抽提pPIC9KIL18，以该质粒为模板，分别以引物a为上游引物，引物b为下游引物和以引物c为上游引物，引物d为下游引物进行首轮PCR，产物应用DNA琼脂糖回收试剂盒回收，分别得到产物ab片段和cd片段。再以引物a为上游引物，引物d为下游引物进行下一轮PCR。最终得到含有RGD序列的DNA片段(图1)。 PCR反应条件为94变性6min，55复性45 s，72延伸45s，30个循环。图1重叠延伸剪接法构建突变体Fig .1Sitedirected mutag

8、enesis by SOE2006, 26(2)卢忠民 等： 人白介素18(IL18)RGD模体抗黑色素瘤细胞B16活性研究中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.2 2006ad片段和质粒pPIC9K分别应用EcoRI、Eco52I进行酶切，用T4DNA连接酶连接，转化DH5菌，提取质粒，应用EcoRI、Eco52I进行双酶切后PCR鉴定。分子克隆测序使用双脱氧末端终止法(由大连宝生物工程公司完成)1.2.2酵母转化及分型和鉴定酵母转化：重组质粒pPIC9KIL18RGD和pPIC9KIL18经SacI酶消化，成为线性质粒, 酶切产物应用TaKaRa P

9、CR Fragment Recovery Kit 切胶回收； 完成GS115感受态细胞制备后，将80l GS115感受态细胞和520g线性DNA混合,并将它们转到一个冰冷的0.2cm的电穿孔小杯中；将带有细胞的小杯放到冰上温育5min；小杯放到电穿孔仪进行电激（参数为7500v/cm、10ms）；立即加1ml冰冷的1mol/L山梨醇，将小杯中的内容物转到一个无菌的微量离心管中；200l铺MD平板，2830过夜培养，直到长出菌落，具体操作参见Invitrogen公司的说明书。Mut+/MutS表型筛选：将上述两种GS115阳性转化子接种到MM和MD平板上，根据在MM和MD平板上生长速度筛选表型。

10、表达质粒整合入酵母基因组鉴定：分别提取含pPIC9KIL18RGD和pPIC9KIL18酵母基因组DNA，应用5AXO1引物（5GACTGGTTCCAATTGACAAGC3）和3 AXO1引物(5GCAAATGGCATTCTGACATCC3)进行PCR鉴定阳性菌落。1.2.3重组蛋白的诱导表达和鉴定重组蛋白的诱导表达：取上述两种阳性菌落的单菌落，分别接种于100mlBMGY培养基中，2830振荡培养，使A=26；1500×g 4离心5min，弃上清并重悬细胞沉淀于25ml BMMY培养基中；继续放入100ml培养瓶中，覆盖两层无菌纱布，再放回培养箱中继续培养；每24小时加100甲醇至

11、终浓度为0.5；在固定时间段取样。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析诱导表达结果：按分子克隆实验操作手册方法分别将两种上清进行SDSPAGE电泳检测，常规固定、染色、脱色、拍照。蛋白质的纯化：Sephadex G100凝胶过滤：将两种经浓缩后的上清，均按下述技术条件进行操作，用002mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)、5mmol/L 巯基乙醇平衡的Sephadex G100柱（2.5cm×95cm）纯化，上样后用上述溶液洗脱，流速为20ml/h，收集各组分，每管2ml，用SDSPAGE分析纯化产物。Westernblot分析：首先将两种SDSPAGE电泳后的蛋白电转化至硝酸纤维素（NC）膜上，用

12、含1%脱脂奶粉的TBS(10mmol/L TrisCl pH=7.5,100mmol/L NaCl) 封闭3h后的NC膜与一抗（兔抗人IL18多克隆抗体）1500反应，4过夜；再将 NC膜与二抗反应（生物素化羊抗兔抗体）1500，37缓慢摇动1h；然后将NC浸于ABC溶液中，37缓慢摇动1h；每一部反应结束后均用TTBS(10mmol/LTrisCl pH=7.5,100mmol/L NaCl, 0.1% Tween20)洗10min×3次。最后将NC膜浸于DAB显色液中，待有特异性条带出现时，水洗NC膜终止显色反应。纯化蛋白质浓度测定方法：按Lowry法，以牛血清白蛋白为标准品。1

13、.2.4表达蛋白生物活性测定纯化产物诱导的人外周血单核细胞IFN含量的测定：将从淋巴细胞分离液分离的人外周血单核细胞（PBMC）用生理盐水悬浮洗涤，然后将细胞重悬于PRMI 1640培养基中(含10%的小牛血清)，并接种于96孔细胞培养板中，每孔中加入不同浓度的IL18RGD（对照组应用IL18）和终浓度为0.5mg/L的Con A，在37，5%的CO2孵箱中培养48h，然后收集细胞上清，用双抗体夹心ELISA法测定IFN含量。IL18RGD对黑色素瘤细胞B16的作用: B16细胞培养于含10%新生小牛血清和bFGF(终浓度为2ng/ml)的DMEM培养基,在37含5%CO2的条件下培养,加入

14、不同浓度的IL18RGD和与之浓度相适应的IL18，继续培养24h,对照为PBS；加入培养液量10%的浓度为0.5mg/ml的MTT继续培养4h;吸去培养液,加入与培养液等量的DMSO（可溶解甲月替结晶）,振荡10min,使结晶充分溶解;应用酶联免疫仪,490nm吸收值;细胞杀伤率=(对照孔均值实验孔均值)/对照孔均值×100%。IL18RGD 对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane, CAM)血管生成的抑制作用:取六日龄鸡胚,用0.1%新洁尔灭消毒;在距绒毛尿囊膜胚头1cm处钻出小窗;无菌玻璃纤维滤纸用bFGF(20ng/disk)饱和，

15、置于CAM上，37孵化24h，分别加入20g的IL18RGD和等量的IL18,以PBS作为对照,置于CAM上,透明胶带覆盖;于37 60%湿度的隔水式恒温敷箱内孵育48h后,用数码相机拍照。IL18RGD对小鼠的B16黑色素实体瘤生长的抑制作用：将9周体重约为20g的C57BL/6小鼠随机分成3组,每组10只,小鼠右腋接种1×106的黑色素瘤细胞,一周后3组分别腹腔注射生理盐水、IL18、IL18RGD，计量均为50g/kg体重，隔天一次。每两天测量肿瘤的大小,共记22天，按照如下方法计算肿瘤的体积：宽2×长×0.526。2结果2.1pPIC9KIL18RGD表达

16、载体的构建和鉴定经SOE方法构建所得到的含有RGD的表达载体应用EcoRI、Eco52I进行双酶切后PCR鉴定，显示一条与目的基因分子量一致的DNA片段，结果如图2。图2重组质粒双酶切鉴定M1、M2：DNA marker1:pPIC9KIL18RGD双酶切结果/EcoRI+Eco52IFig.2Restriction enzyme digestion analysis of therecombinant plasmidM1,M2:DNA marker; 1:pPIC9KIL18RGD/EcoRI+Eco52I引入定点突变后所得到的IL18RGD序列的测序结果如下：突变位置前后10个碱基 测序的

17、峰型图（图3）。图3IL18RGD插入序列前后10个碱基对的核苷酸序列Fig.310 base nucleotide sequence of IL18RGD around inserted2.2pPIC9KIL18RGD和pPIC9KIL18表达载体转化酵母GS115结果鉴定2.2.1Mut+/MutS表型筛选两种GS115阳性转化子在MM和MD平板上生长速度相同，故均为Mut+表型，与用SacI在AOX1位点线性化质粒，转化GS115产生His+和Mut+表型理论相符。2.2.2酵母GS115基因组DNA的PCR鉴定以5AOX1/3AOX1引物对两种酵母GS115的基因组DNA进行PCR扩增

18、，其琼脂糖凝胶电泳结果与预想理论结果均一致，因转化GS115后产生Mut+表型，故一条带为目的基因，另一条约为2.2kb的DNA条带，表明表达载体已经整合到酵母基因组，结果如图4所示。图4酵母基因组IL18RGD及IL18 DNA片段PCR扩增分析M：DNA marker; 1:IL18RGD; 2:IL18Fig.4PCR amplification of IL18RGD and IL18 DNAfragment from yeast genomic DNAM：DNA marker; 1:IL18RGD; 2:IL182.3表达产物的分析鉴定2.3.1酵母上清液的分析鉴定两种酵母分别培养12

19、0h、132h后，上清液经SDSPAGE电泳分析，均在分子量18.3kDa有一条特异蛋白带（图5），与IL18理论分子量一致。图5IL18RDG及IL18在酵母中的表达SDSPAGE分析1：GS115pPIC9KIL18诱导120h; 2:GS115pPIC9KIL18RGD诱导120h;3：GS115pPIC9KIL18诱导132h; 4:GS115pPIC9KIL18RGD诱导132h;M:蛋白质分子量标准Fig.5SDSPAGE analysis of expression of IL18RGD and IL18 in yeast1：GS115pPIC9KIL18 wasinduced

20、for 120h; 2:GS115pPIC9KIL18RGD was induced for 120h;3:GS115pPIC9KIL18 was induced for 132h;4:GS115pPIC9KIL18RGD was induced for 132h;M:Protein molecular weight marker2.3.2蛋白质纯化及鉴定将表达IL18RGD和IL18酵母上清液超滤后上Sephadex G100柱，在280nm处检测蛋白峰,得到两个蛋白质峰，第一个峰为我们所表达的蛋白，其中IL18RGD位于第28管,而IL18位于第30管（图6）。纯化产品应用SDSPAGE进

21、行分析，（图7），用Lowry法测定纯化后的蛋白浓度，IL18RGD可达1.85mg/ml，IL18可达1.91 mg/ml。稀释为50g/ml，用于以后生物活性分析。图6IL18RGD及IL18的Sephadex G100洗脱提纯图(2.5cm×95cm):IL18RGD; :IL18Fig.6Elution diagrams of IL18RGD and IL18 onSephadex G100(2.5cm×95cm):IL18RGD; :IL18图7纯化IL18RGD及IL18蛋白SDSPAGE分析1：IL18RGD纯化蛋白；2：IL18纯化蛋白；M：蛋白质分子量标准

22、Fig.7SDSPAGE analysis of purified IL18RGDand IL18 protein1:purified IL18RGD protein; 2:purified IL18 protein;M:protein molecular weight marker2.3.3Westernblot分析Western blot 分析出现相同灰度的条带说明选择的抗体与IL18识别位点不在RGD位置附近（图8）。图8纯化蛋白的Westem blot分析1：IL18； 2：IL18RGDFig.8Analysis of purified protein by Western blot

23、1：IL18； 2：IL18RGD2.4生物活性测定2.4.1刺激PBMC产生IFN指标结果显示，随着IL18和IL18RGD浓度的增加，细胞培养上清中的IFN含量也随之上升，结果显示，IL18RGD刺激PBMC产生IFN的活性与野生型IL18相当，无显著差异（图9）。图9IL18及IL18RGD诱导人PBMC产生IFN的结果：IL18RGD； ：IL18Fig.9Induction of IFN production by human PBMC：IL18RGD； ：IL182.4.2IL18RGD对黑色素瘤细胞的作用IL18RGD对bFGF诱导的黑色素瘤细胞B16有抑制作用,IC50为8.1

24、0mol/L，而IL18则没有此类抑制作用（图10）。图10IL18及IL18RGD对bFGF诱导的黑色素瘤细胞B16增殖的抑制作用：IL18RGD； ：IL18Fig.10The inhibitory effects of IL18 and IL18RGDon the proliferation of B16 cell induced by bFGF：IL18RGD； ：IL182.4.3IL18RGD 对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用从图1可见，bFGF诱导的CAM主枝血管发达而又清晰（图11.a）,而加入IL18以后血管的生长受到明显的抑制作用(图11.b),而加入IL18RGD后血管

25、数明显减少，而且血管变得不十分清晰（图11.c）。结果显示，IL18RGD对新生血管的抑制作用强于IL18。图11IL18-RGD及IL18 对bFGF诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用(a): 10l bFGF(2ng/l);(b): 10l bFGF(2ng/l) + 20g IL18(c): 10l bFGF(2ng/l) + 20g IL18-RGDFig.11The inhibitory effects of IL18 and IL18RGD on bFGF induced angiogenesis in chick chorioallantoic membranes(a):Fi

26、lter soaked in 10l bFGF alone(2ng/l) ;(b):10l bFGF plus 20g of IL18 ; (c):10l bFGF plus 20g IL18-RGD2.4.4IL18RGD对小鼠的B16黑色素实体瘤生长的抑制作用IL18和IL18RGD均对小鼠的B16黑色素实体瘤生长有抑制作用,而且IL18RGD同IL18相比抑制作用差异也比较显著（图12）。图12IL18RGD及IL18对C57BL/6小鼠黑色素肿瘤生长的抑制作用:IL18RGD; :IL18; ：%0.9NaClFig.12The inhibitory effects of IL18RG

27、D and IL18 on the proliferation of B16 tumor in C57BL/6 mice:IL18RGD; :IL18; ：%0.9NaCl3讨论本文成功利用定点突变及DNA重组技术，在人IL18分子中插入了GGC序列构建了RGD模体。我们注意到RGD作为某些整合素的受体，其构象对其生物活性具有重要影响7，且RGD側翼氨基酸对其结构和功能具有重要作用8。由于IL18蛋白的结构还不是十分清楚，我们可以在IL18的一级结构的几处构建RGD模体，探索性地在第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基，从而构建了RGD模体，通过预实验初步证明该突变体是有活

28、性后便进行更进一步的研究。In vitro研究表明，IL18体外对黑色素瘤细胞株B16没有抑制作用，而应用小鼠作为动物模型研究则对实体瘤具有明显的抑制作用，这可能与IL18抑制肿瘤的机制有关，因为IL18主要通过活化NK和CTL细胞，增加表达Fas配体，当上述杀伤细胞与肿瘤靶细胞结合相互作用时，可将FasL释放至细胞外与相应细胞表达的Fas分子结合，启动细胞死亡信号，导致细胞DNA断裂发生细胞凋亡；国外其他文献也有报道，体外实验无论是IL18还是干扰素都不能单独对肿瘤细胞产生抑制作用，这些结果说明IL18的抗肿瘤作用是通过动物体内的NK细胞介导的 9,10,不同肿瘤抑制需要不同的免疫细细胞参与

29、,也有文献报道CD4+T细胞和CD8+T细胞也起重要作用11。构建RGD模体后，无论是In vitro还是In vivo，IL18RGD均表现出抑制黑色素瘤细胞B16的作用，且比野生型IL18的抗肿瘤生长作用更加显著，这是因为除了IL18本身的作用外，构建的RGD模体可竞争性地与肿瘤表面的受体结合，抑制细胞与基质之间的粘附，达到抑制肿瘤细胞浸润、转移的目的。国内外在这一方面进行了大量研究，Kang等12对含RGD序列的重组salmosin进行研究发现，salmosin可显著抑制B16F10黑色素瘤细胞与细胞外基质蛋白的粘附，并阻止其穿透凝胶基底膜，并有抑制肿瘤细胞聚集的作用,除此而外，RGD还

30、能引起肿瘤细胞的凋亡，这也是抑制黑色素瘤细胞B16的作用增强的重要原因。有文献报道IL18本身也有抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成作用13IL18RGD作用也比IL18强，因为RGD序列可与V3整合蛋白竞争性结合，从而阻断血管上皮细胞增殖的信号传递，终止血管内皮细胞增殖，使血管不能生长，进而导致癌肿组织供养系统中断，细胞萎缩、凋亡，这与有关RGD模体抗血管生成作用的报道相符14,15，故其综合作用得到了加强。综合上述，我们利用基因工程手段对人重组IL18进行了分子改造，将一个甘氨酸残基插入IL18分子中的适当部位，形成RGD模体。从而得到一个全新的蛋白质，它不但具有野生型IL18的免疫抗肿

31、瘤作用机制，还具有RGD模体所特有的抑制肿瘤血管生成的抗肿瘤作用，使之成为多功能的抗肿瘤蛋白，大大地增强了原有IL18的抗肿瘤作用。本工作提示我们，对已有抗肿瘤因子进行改造，增加其生物活性，可能是寻找新的抗肿瘤药物的方向之一。参考文献1 Okamura H， Tsutsi H， Komatsu T， et al Cloning of a new cytokine that induces IFNgamma production by T cells Nature， 1995，378（6552）：88912 Gracie J A, Robertson S E, McInnes I B. Inte

32、rleukin18. J Leukoc Biol, 2003,73(2): 2132243 Nakanishi K, Yoshimoto T, Tsutsui H, et al. Interleukin18 is a unique cytokine that stimulates both Th1 and Th2 responses depending on its cytokine milieu. Cytokine Growth Factor Rev, 2001,12(1):53724 张国荣，赵建增，张晋东,等白细胞介素18基因肌肉注射产生明显抗肿瘤作用中国生物化学与分子生物学报，2001

33、,17（1）：713 Zhang G R，Zhao J Z, Zhang J D, et al. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology， 2001,17（1）：7135 Hiroshi N, Isao H, Tatsuya H,et al. Gene transfer of secretedtype modified Interleukin18 gene to B16F10 melanoma cells suppresses in vivo tumor growth through inhibition of tumor v

34、essel formation. Journal of Investigative Dermatology,2002,119(3):5415486 Boehm T, Folkman J, Browder T, et al. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce aquired drug resistance. Nature ，1997,390：4044077 左之利，周鲁，苏怡,等含有RGD序列多肽构效关系的研究华西药学杂志，2001，17（2）9294 Zuo Z L,Zhou L,Su Y, et al.

35、 WCJ PS,2002,17(2):92948 徐存拴，Rahman S.用定点突变技术鉴定蛇毒解联蛋白RGD侧翼氨基酸残基的结构和功能.生物化学与生物物理学报,2001,33(2):153157Xu C S,Rahman S. Acta Biochimica et Biophysica Sinca,2001,33(2):1531579 Micallef M J，Yoshida K， Kawai S， et al In vivo antitumor effects of murine interferongamma inducing factorinterleukin18 in mice b

36、earing syngeneic Meth A sarcoma malignant ascites Cancer Immunol Immunother，1997，43（6）：36136710 Renthai C, Jacob F, Masashi K. Interleukin18 acts as an angiogenesis and tumor suppressor， The FASEB Journal. 1999,13:2195220211 Qiao L, Abbey L, Carr E J,et al.Synergistic effects of IL12 and IL18 in ske

37、wing tumorreactive TCell responses towards a Type 1 pattern. Cancer Research , 2005,65: 1063107012 Kang I C ,Kim D S ,Jang Y ,et al.Suppressive mechanism of salmosin, a novel disintegrin in B16 melanoma cell metastasis.Biochem Biophys Res Commun,2000,275(1):16917313 Renha I C, Jacob F, Masashi K, et

38、 al. Interleukin18 acts as an angiogenesis and tumor suppressor. The FASEB Journal, 1999,13:2195220214 Chen Y, Xu X, Hong S, et al. RGDTachyplesin inhibit tumor growth.J Cancer Res,2001,61(6):2434243815 Yeh C H, Peng H C,Huang T F, Accutin,a new disintegrin,inhibits angiogenesis in vitro and in in vivo by acting as integrin alphavbeta3 antagonist and inducing apoptosis. J