博士论文答辩

1、LOGO1美味猕猴桃根保肝活性及成分的研究美味猕猴桃根保肝活性及成分的研究 白新鹏白新鹏 二二OO八年六月八年六月2猕猴桃属植物研究概况猕猴桃属植物研究概况简介：猕猴桃是一种野生的简介：猕猴桃是一种野生的大藤大藤本植物本植物。在植物分类学上。在植物分类学上属猕猴属猕猴桃科猕猴桃属植物桃科猕猴桃属植物。又名阳桃、。又名阳桃、羊桃、毛桃、藤梨、中国醋栗、羊桃、毛桃、藤梨、中国醋栗、奇异果奇异果(Kiwifruit)。猕猴桃属在。猕猴桃属在全世界约全世界约60余种，余种，我国是本属植我国是本属植物原生和分布中心物原生和分布中心，共有，共有57-58种，主要分布于长江流域各省的种，主要分布于长江流域各

2、省的山区阴湿地带。山区阴湿地带。 猕猴桃主要分为猕猴桃主要分为六类六类:中华中华猕猕猴桃、猴桃、美味美味猕猴桃、猕猴桃、毛花毛花猕猴桃猕猴桃、软枣软枣猕猴桃、猕猴桃、阔叶阔叶猕猴桃和猕猴桃和葛葛枣枣猕猴桃。猕猴桃。 美味猕猴桃是由中华美味猕猴桃是由中华猕猴桃猕猴桃改良得到改良得到的品种，的品种，已成为我国西南、西北各已成为我国西南、西北各省区猕猴桃种植基地的主栽品种。省区猕猴桃种植基地的主栽品种。绪论绪论绪论绪论3猕猴桃属植物研究概况猕猴桃属植物研究概况果果籽籽叶子叶子绪论绪论枝条枝条根根4三萜类化合物三萜类化合物植物甾醇化合物植物甾醇化合物黄酮类化合物黄酮类化合物糖类化合物糖类化合物挥发性化

3、合物挥发性化合物猕猴桃属主要化学成分猕猴桃属主要化学成分绪论绪论其它微量成分其它微量成分5抗肿瘤和防癌作用抗肿瘤和防癌作用提高免疫功能的作用提高免疫功能的作用抗脂质过氧化作用抗脂质过氧化作用降血脂作用降血脂作用猕猴桃属的生理功能猕猴桃属的生理功能绪论绪论抗突变和畸变作用抗突变和畸变作用6猕猴桃根的化学成分研究概况猕猴桃根的化学成分研究概况n 1、黄初升黄初升 等等 对对毛花毛花猕猴桃根进行了提取、分离得到猕猴桃根进行了提取、分离得到8种物质：种物质：齐墩果酸齐墩果酸、乌乌苏酸苏酸、2, 3-二羟基二羟基-23-氧代氧代-12-烯烯-28-乌苏酸乌苏酸，2，3，23-三羟基三羟基-12-烯烯-2

4、8-乌苏酸，乌苏酸，2，3-二羟基二羟基-12-烯烯-28-乌苏酸，乌苏酸，2，3，24-三羟基三羟基-12-烯烯-28-乌苏乌苏酸，二十四碳酸，葡萄糖等酸，二十四碳酸，葡萄糖等n 2、覃益民覃益民 等等 从从中越中越猕猴桃根中分离得到猕猴桃根中分离得到5个化合物：个化合物：2，3，24-三羟基三羟基-12-烯烯-28-乌苏酸乌苏酸()，2，3，23-三羟基三羟基-12-烯烯-28-乌苏酸乌苏酸()，24-hydroxytormentric acid () 熊果酸熊果酸()，和，和-谷甾醇谷甾醇()等等n 3、李典鹏李典鹏 等等 从从中越中越猕猴桃的根部分离得到猕猴桃的根部分离得到6个化合物个

5、化合物: 2,3,24-三羟基三羟基-12-烯烯-28-齐墩果酸齐墩果酸(), 2,3-二羟基二羟基-12-烯烯-28-乌苏酸乌苏酸(), 2,3,19-三羟基三羟基-12-烯烯-28-乌苏酸乌苏酸(), 熊果酸熊果酸(), -谷甾醇谷甾醇(),和和-胡萝卜甙胡萝卜甙()。n 4、金永日金永日 等，从等，从软枣软枣猕猴桃根中分得猕猴桃根中分得4个化合物：个化合物： -谷甾醇谷甾醇, 毛花猕猴桃酸毛花猕猴桃酸, 2,3,24-三羟基三羟基-12-烯烯-28-乌苏酸和胡萝卜苷。乌苏酸和胡萝卜苷。n 5、李平亚、李平亚 等等 从从狗枣狗枣猕猴桃根中，分离得到两个白色单体。经光谱分析和化猕猴桃根中，分

6、离得到两个白色单体。经光谱分析和化学方法鉴定为学方法鉴定为7-豆甾烯醇豆甾烯醇和具有生物活性的化合物，其结构为和具有生物活性的化合物，其结构为2，3-二二-O一一-D一半乳糖基一一半乳糖基一D一半乳糖，命名为一半乳糖，命名为狗枣三糖狗枣三糖绪论绪论7根的粗提物根的粗提物具有抑制肿瘤细胞作用具有抑制肿瘤细胞作用根的多糖化合物根的多糖化合物具有具有猕猴桃根的药理活性猕猴桃根的药理活性绪论绪论根的粗提物根的粗提物具有免疫功能调节作用具有免疫功能调节作用8国内外研究概况小结国内外研究概况小结绪论绪论 国内外对猕猴桃己有许多研究，主要是关于国内外对猕猴桃己有许多研究，主要是关于栽培栽培、采收、贮藏、采收

7、、贮藏等方面的研究。近年来，对猕猴桃等方面的研究。近年来，对猕猴桃的化学成分、药用价值和加工利用也作了一定的的化学成分、药用价值和加工利用也作了一定的研究，分离出一些三萜化合物等。研究，分离出一些三萜化合物等。但对美味猕猴桃特别是对其根的但对美味猕猴桃特别是对其根的保肝作用保肝作用及及活性活性物质物质的研究未见有文献报道的研究未见有文献报道从现有文献资料可以得到以下信息：从现有文献资料可以得到以下信息：9课题的研究背景和意义课题的研究背景和意义 绪论绪论10主要研究内容主要研究内容绪论绪论11保肝的活性部位确定试验方法保肝的活性部位确定试验方法 荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定

8、n体内模型：选用四氯化碳体内模型：选用四氯化碳 (CCl4) 肝损伤模型作为体内试验模型肝损伤模型作为体内试验模型n体外方法：选用硫氰酸铁体外方法：选用硫氰酸铁 (FTC) 法进行体外抗氧化试验法进行体外抗氧化试验n检测指标：各提取物的抗氧化活性强弱检测指标：各提取物的抗氧化活性强弱 试验小鼠血清试验小鼠血清ALT、AST 肝组织脂质过氧化水平（肝组织脂质过氧化水平（MDA）及谷胱甘肽）及谷胱甘肽(GSH)水平水平n数据处理：釆用数据处理：釆用SPSS10.0统计软件，统计软件，多组间方差分析多组间方差分析统计处理。统计处理。n筛选出其根中具有最强保肝活性的部位。筛选出其根中具有最强保肝活性的

9、部位。12猕猴桃根提取工艺猕猴桃根提取工艺 荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定石油醚萃取物石油醚萃取物石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取美味猕猴桃根美味猕猴桃根600ml/L乙醇、乙醇、50微波浸提微波浸提30min浸泡液浸泡液悬浮液悬浮液浸膏浸膏50以下真空浓缩以下真空浓缩(回收溶剂回收溶剂) 三倍量的水充分搅拌三倍量的水充分搅拌乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃取物(Fr.A)正丁醇萃取物正丁醇萃取物(Fr.B)剩余物剩余物浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏浸膏 活性检测活性检测 活性检测活性检测活性检测活性检测活性检测活性检测真空浓缩真空浓缩真空浓缩真空浓缩真空浓缩真

10、空浓缩真空浓缩真空浓缩13各溶剂提取物抗氧化活性各溶剂提取物抗氧化活性 荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定14各溶剂提取物保肝活性各溶剂提取物保肝活性荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定GroupsDose (mg/kg)Serum ALT (U/L)Serum AST (U/L)Control84.62 4.6593.75 3.76CC14/olive oil2281.52 26.04a762.13 46.35aDGL + CC146088.69 11.35b98.96 10.66bPE + CC1460243.26 13.34 a746.32 15.69 aCE

11、+ CC1460228.34 16.38a b c686.49 41.25a b cEE6 + CC1460123.68 12.65a b328.63 35.35a bME6 + CC1460136.42 14.63a b381.63 26.45a bWE + CC1460196.23 18.10a b c596.61 23.78a b 15不同剂量的不同剂量的EE6对对CCl4肝损伤的影响肝损伤的影响 荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定GroupsDose(mg/kg)Serum ALT(U/L)Serum AST(U/L)Lipid peroxidation(MDA: nmo

12、l/g liver)Glutathione(mg/g liver)Control81.62 6.5195.35 4.0382.62 9.131.91 0.22CC14 / olive 2 278.56 25.64a752.41 64.92a185.64 15.53a1.20 0.12aDGL + CC146096.63 16.33b105.42 30.36b93.62 10.55b1.89 0.19bEE6 + CC1430241.62 24.10a b606.62 41.71a b166.53 16.85a b1.39 0.14a bEE6 + CC1460126.32 12.15a b31

13、6.62 43.71a b122.32 14.53a b1.78 0.16b cEE6 + CC1412095.63 16.52b c116.41 10.32b c88.62 11.56b c1.87 0.17b 16小鼠肝细胞的组织病理学检查小鼠肝细胞的组织病理学检查荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定 对照组对照组(Control group) 攻毒组攻毒组(CCl4/olive oil) 提取物组提取物组(CCl4 + EE6)肝切片电镜图肝切片电镜图17EE6各级萃取部分的抗氧化活性各级萃取部分的抗氧化活性 荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定18EE6各级分各

14、级分CCl4肝损伤活性肝损伤活性 荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定TreatmentDose (mg/kg)p.o.Serum parametersALT(U/L)AST(U/L)Vehicle control80.9615.6895.358.49Vehicle+ CCl42586.2361.23a669.1633.63aDGL + CCl460.0310.12 19.82ab376.0929.90abEEAD+CCl460.0389.4325.81abcd478.99 41.24acdEEAD-Pe +CCl460.0412.6833.64abcd620.29 64.83ac

15、dEEAD-Ea+CCl460.0233.34 19.79abc305.2523.76abcEEAD-Bu+CCl460.0267.6724.84abcd315.7036.82abEEAD-Aq+CCl460.0303.3217.41abd360.29 19 小小 结结 (一一)筛选筛选了了提取溶剂提取溶剂：乙醇乙醇荧光试剂合成荧光试剂合成活性部位确定活性部位确定证明了证明了保肝活性与剂量有一定的关系保肝活性与剂量有一定的关系说明了说明了活性成分主要在乙醇提取物的乙活性成分主要在乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取物中酸乙酯和正丁醇萃取物中提示：提示：各提取物的保肝活性与其抗氧化各提取物的保肝活性

16、与其抗氧化活性有一定相关性活性有一定相关性20三萜化合物定性反应三萜化合物定性反应 三萜化合物的各种三萜化合物的各种特征反应特征反应荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立反应名称反应名称现现 象象乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃取物 正丁醇萃取物正丁醇萃取物醋酐醋酐- -浓硫酸反应浓硫酸反应(Liebermann-(Liebermann-BurchardBurchard反应反应) )黄黄红红紫紫蓝蓝, ,最最后褪色后褪色黄黄红红紫紫蓝蓝, ,最最后褪色后褪色五氯化锑反应五氯化锑反应( (KahlenbergKahlenberg反应反应) )蓝色蓝色蓝色蓝色三氯醋酸反应三氯醋酸反应(Rosen

17、-(Rosen-HeimerHeimer反应反应) )红红紫紫红红紫紫氯仿氯仿- -浓硫酸反应浓硫酸反应( (SalkowskiSalkowski反应反应) )氯仿层呈红色氯仿层呈红色, ,有绿有绿色莹光色莹光氯仿层呈蓝色氯仿层呈蓝色, ,有绿有绿色莹光色莹光冰醋酸冰醋酸- -乙酰氯反应乙酰氯反应( (TschugacffTschugacff反应反应) )淡红色淡红色紫红色紫红色21TLC分离条件的选择分离条件的选择 n最佳展开剂：氯仿最佳展开剂：氯仿+甲醇甲醇+水水(70+30+1)n最佳显色剂：最佳显色剂：荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立22TLC最佳条件的展开效果最佳条件

18、的展开效果 荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立23分光光度法测定总三萜分光光度法测定总三萜 荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立24分光光度法测定总三萜分光光度法测定总三萜荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立25分光光度法测定总三萜分光光度法测定总三萜荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立26分光光度法测定总三萜分光光度法测定总三萜荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立27HPLC测定测定oleanolic acid n色谱柱：色谱柱：250mm4.6mm i.d， 5m Luna C18n流动相流动相: 乙腈乙腈+甲酸甲酸+水水(60

19、+0.08+39.92) n进样量：进样量：10L; 流速：流速：1.0mL/minn柱温：柱温：25n紫外检测器紫外检测器n检测波长：检测波长：206 nm 荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立28HPLC测定测定oleanolic acid荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立29HPLC测定测定oleanolic acid检测方法建立检测方法建立30实际样品总三萜和实际样品总三萜和oleanolic acid含量测定含量测定 荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立提取物提取物总三萜的含量总三萜的含量(mg/g ) oleanolic acid(mg/g )

20、石油醚提取物石油醚提取物 (PE)120.22.4三氯甲烷提取物三氯甲烷提取物 (CE) 187.23.660%乙醇提取物乙醇提取物 (EE6)251.84.460%甲醇提取物甲醇提取物(ME6)126.83.8水提取物水提取物 (WE)31实际样品总三萜和实际样品总三萜和oleanolic acid含量测定含量测定 荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立提取物提取物总三萜的含量总三萜的含量(mg/g )oleanolic acid(mg/g )乙醇粗提取物乙醇粗提取物 (EEAD)256.44.8石油醚萃取物石油醚萃取物 (EEAD-Pe) 43.61.1乙酸乙酯萃取物乙酸乙酯萃取

21、物 (EEAD-Ea)516.28.6正丁醇萃取物正丁醇萃取物(EEAD-Bu)276.34.1水萃取物水萃取物(EEAD-Aq)32 小小 结结(二二)验证了验证了活性部分含有三萜化合物。活性部分含有三萜化合物。确定了确定了TLC分离条件。分离条件。建立了建立了TLC-HPLC法测定法测定oleanolic acid含量的含量的方法。方法。荧光试剂合成荧光试剂合成检测方法建立检测方法建立33微波辅助提取设备微波辅助提取设备 荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺34微波辅助提取方法微波辅助提取方法 称取称取10.0 g猕猴桃根粉猕猴桃根粉样品样品，置于特制的，置于特制的500 ml

22、两口烧瓶中，根据两口烧瓶中，根据试验试验设计要求的工艺条件设计要求的工艺条件，加入所需的提取溶剂乙醇，并确保溶剂完全淹没样品，加入所需的提取溶剂乙醇，并确保溶剂完全淹没样品，把装有样品的烧瓶放入上述的微波萃取系统中，装上搅拌器及回流装置，设把装有样品的烧瓶放入上述的微波萃取系统中，装上搅拌器及回流装置，设定加热功率、温度、时间，定加热功率、温度、时间，进行微波萃取进行微波萃取。处理结束后，取出烧瓶，将萃取。处理结束后，取出烧瓶，将萃取液液过滤过滤，滤液经真空，滤液经真空浓缩浓缩（T 50 oC）至一定体积后取出一定量的浓缩液，）至一定体积后取出一定量的浓缩液，定容到一定的体积，进行定容到一定的

23、体积，进行三萜含量分析三萜含量分析，同时取出一量的浓缩液，在旋转蒸，同时取出一量的浓缩液，在旋转蒸发仪上蒸至一定程度，放入干燥器内，至到恒重，测定重量，发仪上蒸至一定程度，放入干燥器内，至到恒重，测定重量，推算出浸膏的推算出浸膏的收率及纯度收率及纯度。提取率定义：提取率定义：荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺35提取过程优化方法提取过程优化方法 荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺n单因素试验单因素试验：找出各因素对浸取效能的影响，确定各因：找出各因素对浸取效能的影响，确定各因素的取值范围。素的取值范围。n析因试验析因试验(FFD): 确定影响提取效果的主要因素。快速

24、确定影响提取效果的主要因素。快速上升试验确定显著影响因素的最佳中心点，上升试验确定显著影响因素的最佳中心点，n中心组合试验中心组合试验(CCD)：对主要因素进行优化组合，拟：对主要因素进行优化组合，拟合稳定点附近的响应模型，并优化得出最佳工艺条件和最大提合稳定点附近的响应模型，并优化得出最佳工艺条件和最大提取率。取率。n验证试验验证试验：证明该方法的可靠性：证明该方法的可靠性。整个试验分整个试验分3个阶段进行个阶段进行36单因素影响实验单因素影响实验 n 微波微波功率功率对提取率的影响对提取率的影响n 微波辐射微波辐射时间时间对提取率的影响对提取率的影响n 微波萃取微波萃取温度温度对提取率的影

25、响对提取率的影响n 溶剂溶剂浓度浓度对提取率的影响对提取率的影响n 料液比料液比对提取率的影响对提取率的影响n 预预浸泡时间浸泡时间对提取率的影响对提取率的影响荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺37单因素影响实验单因素影响实验(1) (2)荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺38单因素影响实验单因素影响实验(3) (4)荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺39单因素影响实验单因素影响实验(5) (6)荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺40辐射温度辐射温度微波功率微波功率料液比料液比乙醇体积分数乙醇体积分数辐射时间辐射时间预浸泡时间预浸泡时间荧

26、光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺单因素实验最佳条件单因素实验最佳条件41析因试验析因试验析因试验设计因子及编码值析因试验设计因子及编码值荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺水平水平(X)乙醇浓度乙醇浓度1 / %液料比液料比2 / (v/ w)提取时间提取时间3 /min提取温度提取温度4 / -130101040050153050+42析因试验析因试验 荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺NoX1X2X3X4三萜提取率三萜提取率 Y1/ %1-1-1-1-138.8221-1-1-170.013-11-1-140.98411-1-182.945-1-11

27、-135.3561-11-185.337-111-145.518111-185.739-1-1-1140.97101-1-1170.9911-11-1142.481211-1166.8913-1-11137.73141-11165.1615-43析因试验析因试验荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺TermEstimateStd ErrtPr|t|X133.323752.46124113.539410.0001X24.556252.4612411.85120.123358X32.126252.4612410.8638930.427136X4-5.521252.461241-2.243

28、280.074906结果的回归分析结果的回归分析44最速上升试验最速上升试验荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺试验编号试验编号12345乙醇浓度乙醇浓度1 /%5060708090提取温度提取温度4 /5045403530三萜提取率三萜提取率Y1 /%78.1283.9676.3553.1045.20试验方案及结果试验方案及结果45Box-Behnken中心组合试验中心组合试验试验因素与水平的编码表试验因素与水平的编码表(=1.414)荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺因素因素水水 平平-10+1+1 乙醇浓度乙醇浓度 / %45.8650607074.144 提取

29、温度提取温度 / 46Box-Behnken中心组合试验中心组合试验试验方案及试验结果试验方案及试验结果荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺No.X1X4三萜提取率三萜提取率/ %1-1-169.862-1168.2831-173.2141175.165-1.414063.1261.414078.0270-47Box-Behnken中心组合试验中心组合试验荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺48Box-Behnken中心组合试验中心组合试验荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺结果的直观图结果的直观图49提取温度提取温度乙醇体积分数乙醇体积分数料液比料液比1:

30、15提取时间提取时间30 min荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺50最佳实验条件验证最佳实验条件验证 最佳条件下的实验结果最佳条件下的实验结果荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺实验条件实验条件实验次数实验次数平均提取率平均提取率(%)123最佳条件最佳条件85.2384.9585.3685.136号条件号条件84.1583.8984.3284.128号条件号条件51 小小 结结 (三三)微波辅助提取微波辅助提取猕猴桃根中三萜类生物活性物质猕猴桃根中三萜类生物活性物质是一是一行之有效的方法行之有效的方法RSM 法法可以用于微波提取猕猴桃根三萜化合可以用于微波提取猕猴

31、桃根三萜化合物的工艺条件物的工艺条件优化处理过程优化处理过程荧光试剂合成荧光试剂合成微波提取工艺微波提取工艺52树脂纯化三萜所用材料树脂纯化三萜所用材料 荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺树脂树脂极性极性外观外观比表面比表面(m2/g) 平均孔径平均孔径S-8极性极性乳白色不透明球状颗粒乳白色不透明球状颗粒100-120280-300NAK-9极性极性红棕色不透明球状颗粒红棕色不透明球状颗粒160-200145-155AB-8弱极性弱极性乳白色不透明球状颗粒乳白色不透明球状颗粒480-520130-140HPD700中极性中极性乳白色不透明球状颗粒乳白色不透明球状颗粒650-70

32、085-90D-101非极性非极性乳白色不透明球状颗粒乳白色不透明球状颗粒500-55080-53树脂纯化实验内容树脂纯化实验内容 n 总三萜吸附容量的测定总三萜吸附容量的测定n 总三萜解吸率的测定总三萜解吸率的测定n 静态吸附等温线实验静态吸附等温线实验n 静态吸附动力学特性的测定静态吸附动力学特性的测定荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺n 总三萜动态吸附量的测定总三萜动态吸附量的测定n 总三萜洗脱条件的测定总三萜洗脱条件的测定n 验证实验验证实验54静态吸附实验静态吸附实验 分别准确称取经预处理的干树脂分别准确称取经预处理的干树脂2 g装入装入150 ml的锥形瓶中，的锥形瓶

33、中，再加再加50 ml 浓度为浓度为4.976 mg/ml总三萜乙醇溶液，静态吸附至总三萜乙醇溶液，静态吸附至24 h后，充分吸附后，过滤，测定溶液中总三萜化合物的浓度后，充分吸附后，过滤，测定溶液中总三萜化合物的浓度重量吸附量和吸附率定义：重量吸附量和吸附率定义：荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺%100)(0WVCeCQ %100%00CCeCE 55静态吸附实验静态吸附实验荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺56静态吸附实验静态吸附实验荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺57静态吸附实验静态吸附实验荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺58

34、静态吸附实验静态吸附实验荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺1eeemLmCCQQK Q Ln Q e= ln Kf +n ln C59静态吸附实验静态吸附实验荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺 60静态吸附实验静态吸附实验树脂种类树脂种类回归方程回归方程Qm KLR2NAK-9Ce/Qe=0.0143Ce+0.045769.930.31290.9808HPD700Ce/Qe=0.0076Ce+0.0388131.580.19590.9607D101Ce/Qe=0.0068Ce+0.0332147.060.20480.9244荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯

35、化工艺 树脂种类树脂种类回归方程回归方程Kf nR2NAK-9lnQe=0.7869lnCe+2.75415.710.78690.9878HPD700lnQe=0.8527lnCe+3.02720.640.85270.9940D101lnQe=0.8567lnCe+61静态吸附实验静态吸附实验荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺 62动态吸附实验动态吸附实验 荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺 63动态吸附实验动态吸附实验 荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺 64动态吸附实验动态吸附实验 荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺 65上样浓度上样

36、浓度上样量：上样量：14 倍树脂体积倍树脂体积流速：流速：5 ml/min荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺树脂类型树脂类型66最佳条件纯化产品结果最佳条件纯化产品结果 荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺 实验实验上样提取物上样提取物(g)纯化产品重量纯化产品重量(g)纯化后总三萜含量纯化后总三萜含量(mg/g)产品收率产品收率(%)三萜回收率三萜回收率(%)15.632.81514.249.9188.0125.652.83521.350.0989.5435.672.82518.349.7488.40平均平均67最佳条件纯化产品结果最佳条件纯化产品结果 荧光试剂合成

37、荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺 68 小小 结结 (四四)lnQe=0.8567lnCe+3.171荧光试剂合成荧光试剂合成树脂纯化工艺树脂纯化工艺69单体活性物质的纯化工艺单体活性物质的纯化工艺 荧光试剂合成荧光试剂合成活性单体纯化活性单体纯化树脂纯化总三萜树脂纯化总三萜 硅胶柱层析硅胶柱层析 氯仿氯仿-甲醇甲醇 梯度洗脱梯度洗脱 TLC合并相同点合并相同点 Fr (2) Fr (3)Fr (4)Fr (5)Fr (1)动物实验动物实验 动物实验动物实验动物实验动物实验动物实验动物实验动物实验动物实验Sephadex LH-20 ABCD各部分反复各部分反复ODS柱层析柱层析 IIII

38、IIIV70柱层析分离条件柱层析分离条件荧光试剂合成荧光试剂合成活性单体纯化活性单体纯化n 上样量：上样量：4克克n 洗脱剂：氯仿洗脱剂：氯仿-甲醇甲醇(100+00+100)梯度洗脱梯度洗脱n 洗脱速度：洗脱速度：1-2 ml/minn 柱子类型：柱子类型：20 mm200 mmn 洗脱剂：水洗脱剂：水+甲醇甲醇(100+00+100)梯度洗脱梯度洗脱n 洗脱速度：洗脱速度：1-2 ml/71硅胶柱层析分离结果硅胶柱层析分离结果荧光试剂合成荧光试剂合成活性单体纯化活性单体纯化组号组号洗脱液比例洗脱液比例氯仿氯仿+甲醇甲醇收集瓶序号收集瓶序号收集液颜色收集液颜色收率收率%三萜含量三萜含量(mg

39、/g)Fr (0)纯氯仿纯氯仿1-10蒸干后棕红色油状蒸干后棕红色油状Fr (1)9+1- 8+211-54红色红色8.4115.24Fr (2)8+2- 7+355-88淡红色淡红色12.97340.23Fr (3)7+3- 6+489-129灰白色灰白色30.06780.36Fr (4)6+4- 5+5129-150淡绿淡绿15.43346.91Fr (5)5+5- 4+6150-189灰白色灰白色6.3434.25Fr (6)纯甲醇纯甲醇189-210灰白色灰白色72硅胶柱层析分离结果硅胶柱层析分离结果荧光试剂合成荧光试剂合成活性单体纯化活性单体纯化73硅胶柱层析分离结果硅胶柱层析分离结

40、果荧光试剂合成荧光试剂合成活性单体纯化活性单体纯化TreatmentDose(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)Lipid peroxidation(nmol/g liver)Glutathione(mole/g liver)Vehicle control 120.86 11.20124.68 12.5959.32 2.156.13 0.22Vehicle+CCl41120.68 57.19a1042.69 39.56a119.12 3.59a2.27 0.12aDGL + CCl460.0578.2 41.50ab599.41 34.99ab88.07 3.64ab4.59 0.3

41、8abFr (1)+ CCl460.0860.45 8.42abcd784.8 56.53abcd99.51 6.32abcd3.06 0.15abcdFr (2)+ CCl460.0633.64 8.48abcd562.91 43.28abd88.98 2.03abd3.60 0.19abcdFr (3)+ CCl460.0421.33 37.35abc430.96 36.92abc76.61 4.49abc5.22 0.27abcFr (4)+ CCl460.0598.22 40.19abd590.42 47.36abd87.08 2.46abd4.47 0.24abdFr (5)+ CC

42、l460.0597.27 45.74abd699.21 8.83abcd82.39 3.48abcd4.38 74单体活性物质的纯化结果单体活性物质的纯化结果 荧光试剂合成荧光试剂合成活性单体纯化活性单体纯化75单体化合物的结构表征单体化合物的结构表征 n 熔点熔点 n 紫外光谱紫外光谱n 红外吸收光谱红外吸收光谱n 高效液相谱高效液相谱 n 液液-质色谱质色谱 n 核磁共振谱核磁共振谱 (1H-NMR、 13C-NMR、DEPT谱谱 )荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征76四个单体化合物的四个单体化合物的熔点熔点n化合物化合物I ：291-292 n化合物化合物II ：283-287

43、n化合物化合物III ：308-310 n化合物化合物IV ：312-315 结构表征结构表征77 四个单体化合物的四个单体化合物的紫外光谱紫外光谱荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征n化合物化合物I ：n化合物化合物II ：n化合物化合物III ：n化合物化合物IV ：78四个单体化合物的四个单体化合物的荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征669.40997.191029.831091.011252.681274.471386.431454.691572.781691.772851.472923.353420.17 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

44、 120 130 140%T 500 1000 1500 2000 2000 3000 W avenumbers (cm-1)79四个单体化合物的四个单体化合物的 荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征80四个单体化合物的四个单体化合物的1H-NMR谱谱荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征81四个单体化合物的四个单体化合物的荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征82化合物的化合物的 荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征8313C-NMR谱化学位移数据谱化学位移数据 荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征84化合物的结构表征化合物的结构表征HCOOHHH13568101112151

45、718202223242526272930HO13456791011121315171819202122CH2OH2324OH2526272930COOH28OH荧光试剂合成荧光试剂合成结构表征结构表征HCOOHHH13568101112151718202223242526272930HO13456791011121315171819202122CH2OH2324OH2526272930COOH28OHOHOleanolic acidUrsolic acid2,3,23-三羟基三羟基-12-烯烯-28-乌苏酸乌苏酸85单体化合物与总三萜保肝活性比较单体化合物与总三萜保肝活性比较 荧光试剂合成荧

46、光试剂合成保肝功能研究保肝功能研究总三萜总三萜TreatmentDose(mg/kg)ALT(U/L)AST(U/L)Lipid peroxidation(nmol/g liver) Glutathione(mole/g liver)Vehicle control84.92 21.20122.48 19.9857.03 3.145.56 0.24Vehicle+ CCl41071.42 47.87a774.83 49.51a108.29 5.59a2.55 0.16aFr (3)+ CCl425.0568.85 38.24ab473.45 46.76ab79.66 4.22ab3.59 0.2

47、5abFr (3)+ CCl450.0430.36 43.63ab405.67 33.29ab76.73 3.03ab4.24 0.23abFr (3)+ CCl4100.0269.47 28.65ab282.26 29.28ab70.88 3.56ab4.68 0.34abFr (3)+ CCl4200.0106.02 27.56bNS149.6528.93bNS62.69 5.49bNS5.46 0.29bNSOLA+ CCl4156.0546.26 51.50ab486.88 48.23ab81.25 6.04ab3.96 0.26abOLA+ CCl4300.0420.56 41.59

48、ab398.36 41.59ab73.73 2.83ab4.34 86 小小 结结 (五五) Sephadex-LH-20柱柱 采用采用UV、MS、1H-NMR和和13C-NMR进行进行结构分析结构分析，确定，确定分别为分别为Oleanolic acid， Ursolic acid， 2,3,23-三羟基三羟基-12-烯烯-28-乌苏酸，乌苏酸， 2,3,19,23-四羟基四羟基-12-烯烯-28-乌苏酸乌苏酸 齐墩果酸不是单一的保肝作用成分，猕猴桃根的齐墩果酸不是单一的保肝作用成分，猕猴桃根的保肝作用是三萜化合物群的保肝作用是三萜化合物群的协同作用协同作用荧光试剂合成荧光试剂合成小小 结结8

49、7主要结论主要结论 n成功成功建立了建立了保肝动物保肝动物模型模型，为保肝活性物质的提取、分离、纯化提供，为保肝活性物质的提取、分离、纯化提供检测手段检测手段。n对猕猴桃根进行分级提取，对提取物进行活性检测，结果表明：醇提取物的对猕猴桃根进行分级提取，对提取物进行活性检测，结果表明：醇提取物的抗氧化抗氧化和保肝活性和保肝活性较好；较好；微波提取法微波提取法不影响提取物的保肝活性；醇提物的不影响提取物的保肝活性；醇提物的乙酸乙酯乙酸乙酯萃取物萃取物具有较高的抗氧化和保肝活性具有较高的抗氧化和保肝活性 。n建立了建立了总三萜含量的总三萜含量的TLC-分光光度分光光度测定法和齐墩果酸含量的测定法和齐墩果酸含量的TLC-HPLC测定法。测定法。TLC法适宜的法适宜的展开剂展开剂：氯仿：氯仿+甲醇甲醇+水水(7+3+1)；分光光度法显色反应的适宜；分光光度法显色反应的适宜条件条件：50g/L香草醛醋酸溶液香草醛醋酸溶液0.3 ml，高氯酸，高氯酸1 ml，60 oC反应反应15 min。采用。采用TLC-HPLC法法适宜的适宜的条件条件为：采用为：采用LunaC18柱，流动相：乙腈柱，流动相：乙腈+甲酸甲酸+水水(6