分子生物学-7

1、核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术核酸的变性与复性核酸的变性与复性 在某些理化因素作用下，核酸分子中互补碱基之间氢在某些理化因素作用下，核酸分子中互补碱基之间氢键的断裂叫核酸的键的断裂叫核酸的变性变性 (denaturation)。 DNA 发生变性时，发生变性时，DNA 双螺旋解体，变成两条单链；双螺旋解体，变成两条单链； RNA 发生变性时，其分子内部形成的局部双链被破坏，发生变性时，其分子内部形成的局部双链被破坏，使使 RNA 失去原有的空间结构。失去原有的空间结构。 使核酸变性的方法：使核酸变性的方法：加热加热过量的酸、碱过量的酸、碱化学变性剂，如尿素、甲醛、甲酰胺化学变性剂，如尿素、甲

2、醛、甲酰胺DNA 变性的本质是变性的本质是 DNA 双链间双链间氢键的断裂。氢键的断裂。DNA 变性是在一个相当窄的变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范温度范围内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最围内，紫外光吸收值达到最大值的大值的 50% 时的温度为时的温度为 DNA 的解链温度，又称融解的解链温度，又称融解温度温度 (melting temperature, Tm)。Tm = 69.3 + 0.41 (%G + C)DNA 解链曲线解链曲线 在适当条件下，变性在适当条件下，变性 DNA 的两条互补链的两条互补链重新缔合，重新缔合，恢恢复天然的双螺旋构象，这一复天然的双螺旋构象，

3、这一过程过程称为称为复性复性 (renaturation)。 DNA 的变性的变性与复性是可逆的过程。与复性是可逆的过程。退火退火 (annealing) 两条互补的两条互补的 DNA 单链或一条单链或一条 DNA 单链与单链与其其互补的互补的 RNA 链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交链形成双链核酸分子的过程称为核酸分子杂交 (Hybridization of nuclei acids)。 核酸分子杂交核酸分子杂交通常是通常是指指探针探针 (probe) 受体受体 DNA 或或 RNA 分子的之间的杂交。分子的之间的杂交。 探针探针是用同位素或非同位素标记的序列已知的核苷酸是用同位素或

4、非同位素标记的序列已知的核苷酸链链 (单链单链 DNA 或或 RNA 分子分子)，用于鉴别、分离基因以及，用于鉴别、分离基因以及检测基因的表达。检测基因的表达。核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交类型及特点核酸分子杂交类型及特点转膜转膜 (印迹印迹)琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳制备受体制备受体 DNA/RNA洗膜洗膜检测探针检测探针制备探针制备探针预杂交预杂交杂交杂交一、探针的标记一、探针的标记1. 同位素标记的探针同位素标记的探针 常用的同位素为常用的同位素为 32P、35S2. 非同位素标记的探针非同位素标记的探针 高度灵敏感高度灵敏感; 便于检测便于检测 利用显色反应、化学发光法、荧光素

5、、若丹明等检测利用显色反应、化学发光法、荧光素、若丹明等检测杂交的探针杂交的探针; 探针稳定，并且可被反复使用多次；探针稳定，并且可被反复使用多次； 不会危害操作者的健康并且不污染环境；不会危害操作者的健康并且不污染环境； 常用的非同位素标记常用的非同位素标记 地高辛地高辛 (Digoxigenin, DIG) 生物素生物素 (Biotin) 3DIG 标记标记探针的方法探针的方法 探针类型探针类型 标记方法标记方法 酶和引物酶和引物 结合的结合的 DIG 分子数分子数DNA 探针探针随机引物标记法随机引物标记法Klenow 片段；片段；六核苷酸引物六核苷酸引物每每 25-36 个核苷酸个核苷

6、酸 1 个个 缺口平移法缺口平移法DNase I 和和DNA 聚合酶聚合酶 I每每 25-36 个核苷酸个核苷酸 1 个个PCR 法法Taq DNA 聚合酶聚合酶每每 25 个核苷酸个核苷酸 1 个个cDNA 探针探针逆转录法逆转录法AMV 逆转录酶逆转录酶每每 25-36 个核苷酸个核苷酸 1 个个寡核苷酸探针寡核苷酸探针3末端标记末端标记末端转移酶末端转移酶3末端只有一个末端只有一个3末端加尾标记末端加尾标记末端转移酶末端转移酶每每 12 个核苷酸个核苷酸 1 个个5末端标记末端标记化学法化学法5末端只有一个末端只有一个RNA 探针探针体外转录法体外转录法噬菌体噬菌体 SP6、T3 和和T

7、7 RAN 聚合酶聚合酶每每 25-36 个核苷酸个核苷酸 1 个个二、二、DNA/RNA 样品的制备及电泳样品的制备及电泳1. DNA 样品样品制备基因组制备基因组 DNA;限制性内切酶酶切限制性内切酶酶切基因组基因组 DNA; 用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的基因组 DNA2. RNA 样品样品制备总制备总 RNA;用变性琼脂糖凝胶电泳用变性琼脂糖凝胶电泳分离分离 RNA三、三、DNA/RNA 从凝胶向膜的转移从凝胶向膜的转移 - 印迹印迹 (blotting)1. 转移方法转移方法毛细管转移毛细管转移 (Capillary transfer) 在缓冲液中，在缓冲

8、液中，DNA 或或 RNA 从凝胶中被动地转移到膜上，从凝胶中被动地转移到膜上， 用于用于 Southern 印迹和印迹和 Northern 印迹。印迹。 真空转移真空转移 (Vacuum blotting) 真空加快转移速度，用于真空加快转移速度，用于 Southern 印迹、印迹、Northern 印印 迹、斑点或狭缝杂交。迹、斑点或狭缝杂交。电转移电转移 (Electroblotting) 电流加快转移速度，适用于聚丙烯酰胺凝胶。电流加快转移速度，适用于聚丙烯酰胺凝胶。2. 膜支持物膜支持物(1) 尼龙膜尼龙膜 (Nylon membrane)带正电荷带正电荷尼龙膜结合尼龙膜结合 DNA

9、 及及 RNA 的能力大于的能力大于不不带带电荷电荷的尼龙膜；的尼龙膜；尼龙膜的尼龙膜的耐用性高耐用性高 ，利于探针的去除，利于探针的去除 (stripping) 和重新和重新杂交杂交 (reprobing)；适用于适用于底物显色反应底物显色反应和化学发光法检测杂交的探针。和化学发光法检测杂交的探针。(2) 硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜 (Nitrocellulose membrane)NC 膜结合膜结合 DNA 及及 RNA 的效率低于的效率低于尼龙膜尼龙膜；NC 膜的强度低、易碎，不利于探针的去膜的强度低、易碎，不利于探针的去除除和重新杂交；和重新杂交；适用于底物显色法检测杂交的探针。适用于底

10、物显色法检测杂交的探针。毛细管转移毛细管转移真空转移装置真空转移装置用于用于 Southern 印迹印迹和和 Northern 印迹印迹用于斑点杂交用于斑点杂交 (右右) 狭缝杂交狭缝杂交 (左左) 3. 转移缓冲液转移缓冲液高离子强度缓冲液高离子强度缓冲液 20X SSC (3M NaCl; 0.3M Sodium citrate, pH7.0) 为常为常用的用的转移缓冲液；转移缓冲液；在在 DNA 转膜之前，用转膜之前，用 NaOH/NaCl 或或 20X SSC 等等将将双双链链 DNA 分子变性为单链分子变性为单链 DNA 分子；分子；在在 RNA 转膜之前，转膜之前，用用 20X S

11、SC 处理处理变性的琼脂糖凝胶，变性的琼脂糖凝胶，以去除凝胶中的变性剂甲醛。以去除凝胶中的变性剂甲醛。四、将四、将 DNA/RNA 固定在膜上的方法固定在膜上的方法1. 干烤干烤 置尼龙膜于抽真空的置尼龙膜于抽真空的 120 C 烤箱中烤箱中 2 小时；小时； 置硝酸纤维素膜于抽真空的置硝酸纤维素膜于抽真空的 80 C 烤箱中烤箱中 2 小时。小时。 2. UV 交联作用交联作用 用用 UV 将将 DNA/RNA 固定在尼龙膜上。固定在尼龙膜上。UV 交联仪交联仪 (UV Crosslinker)五、五、DIG 探针与靶分子的杂交探针与靶分子的杂交1. 探针探针 杂交前用热变性方法将双链杂交前

12、用热变性方法将双链 DNA 探针变性为单链探针变性为单链 DNA 探针。探针。2. 杂交条件杂交条件 保证探针与靶分子特异杂交。保证探针与靶分子特异杂交。3. 洗膜洗膜 使探针与非特异杂交的序列分离。使探针与非特异杂交的序列分离。探针与靶分子的杂交探针与靶分子的杂交六、六、DIG 探针的检测探针的检测1. 在抗在抗 DIG 抗体上偶联荧光素抗体上偶联荧光素 用于原位杂交用于原位杂交2. 在抗在抗 DIG 抗体上偶联抗体上偶联碱性磷酸酶碱性磷酸酶，以碱性磷酸酶催，以碱性磷酸酶催化的底物显色反应或化学发光反应检测化的底物显色反应或化学发光反应检测 DIG 探针信号。探针信号。(1) 用于显色反应的

13、底物用于显色反应的底物 NBT (氮蓝四唑盐酸盐氮蓝四唑盐酸盐) BCIP (5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚磷酸盐吲哚磷酸盐) (2) 用于化学发光反应的底物用于化学发光反应的底物 CSPD 和和 CDP-Star用碱性磷酸酶检测用碱性磷酸酶检测 DIG 探针探针显色反应的底物：显色反应的底物：NBT, BCIP 化学发光反应化学发光反应的的底物：底物：CSPD, CDP-Star化学发光化学发光反应反应显色反应显色反应Southern 印迹印迹将将变性的变性的 DNA 分子分子 (单链单链) 转印到转印到尼龙尼龙膜上膜上琼脂糖凝胶电泳分离酶切的琼脂糖凝胶电泳分离酶切的 DNA 片段片段用限制性

14、内切酶酶切基因组用限制性内切酶酶切基因组 DNA预杂交：降低探针与膜结合的机会预杂交：降低探针与膜结合的机会杂交：杂交：探针与靶探针与靶分子杂交分子杂交洗膜：洗去非特异结合探针洗膜：洗去非特异结合探针检测探针检测探针DNA 芯片芯片技术技术 DNA 芯片芯片 (DNA Chip) 技术是一种大规模集技术是一种大规模集成的固相杂交。成的固相杂交。 在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量预先制备的大量预先制备的 DNA 探针有序地固化于支持物探针有序地固化于支持物表面，然后与标记的表面，然后与标记的 DNA 或或 RNA 样品杂交。样品杂交。 通过检测

15、杂交信号来分析样品的基因序列或表通过检测杂交信号来分析样品的基因序列或表达信息。达信息。 ArrayerHybridization Oven Array ScannermRNAmRNAmRNAmRNA正常细胞正常细胞mRNAcDNA(红色荧光染料标记的红色荧光染料标记的 cDNA)异常细胞异常细胞mRNAcDNA(绿色荧光染料标记的绿色荧光染料标记的 cDNA)与芯片杂交与芯片杂交只在只在正常细胞中表达的基因正常细胞中表达的基因只在只在异常细胞中表达的基因异常细胞中表达的基因在正常细胞在正常细胞在在异常细胞中等异常细胞中等量表达的基因量表达的基因在正常细胞中高表达的基因在正常细胞中高表达的基因

16、在异常细胞中高表达的基因在异常细胞中高表达的基因在正常细胞在正常细胞在在异常细胞中都异常细胞中都不表达的基因不表达的基因DNA 序序列列测测定定DNA 聚合酶聚合酶一、双脱氧链终止法一、双脱氧链终止法 (Sanger 法法) 在在 DNA 聚合酶的催化下，聚合酶的催化下，2, 3-ddNTP 底物底物通过其通过其 5 -P 基团掺入到延伸的基团掺入到延伸的 DNA 链中；由于链中；由于缺少缺少 3 -OH，后续，后续 dNTP 不能与其形成磷酸二酯不能与其形成磷酸二酯键，导致键，导致 DNA 链的合成终止。链的合成终止。DNA 测序过程测序过程 退火反应退火反应: 使待测使待测 DNA 模板热

17、变性为单链模板热变性为单链 DNA，与测序，与测序引物发生退火。引物发生退火。 标记反应标记反应: 单链单链 DNA 模板模板-引物、引物、dNTP、 -35SdATP 和测序酶和测序酶 (DNA 聚合酶聚合酶)。 终止反应终止反应: 将标记反应混合物分成四组，分别加入含有将标记反应混合物分成四组，分别加入含有 ddATP、ddTTP、ddCTP 和和 ddGTP 的终止反应液。的终止反应液。 电泳电泳: 用变性聚丙烯酰胺凝胶分离新合成的用变性聚丙烯酰胺凝胶分离新合成的 DNA 片段。片段。 放射自显影放射自显影: 根据根据 X-光胶片上条带的位置，读出新合成光胶片上条带的位置，读出新合成 D

18、NA 片段的核苷酸顺序，从而得知待测片段的核苷酸顺序，从而得知待测 DNA 链的核苷酸链的核苷酸顺序。顺序。测序反应所产生的系列单链测序反应所产生的系列单链 DNA 片段始片段始于测序引物结合位点并终止于于测序引物结合位点并终止于 ddNTP。放射自显影放射自显影变性聚丙烯酰胺变性聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳待测链序列待测链序列二、基于双脱氧链终止法的自动化二、基于双脱氧链终止法的自动化 DNA 测序测序 用荧光素代替同位素来标记用荧光素代替同位素来标记 DNA 分子，荧光素分子，荧光素分子被激光激活后分子被激光激活后, 再被光电倍增管捕获。再被光电倍增管捕获。1. 末端染色测序末端染色测序 用

19、四种不同的荧光素分子分别标记四种双脱氧核用四种不同的荧光素分子分别标记四种双脱氧核苷酸分子，测序反应产物的苷酸分子，测序反应产物的 3 末端带有不同的荧光末端带有不同的荧光素分子。素分子。2. 引物染色测序引物染色测序DNA 模板模板 测序引物测序引物dATP, dGTP, dCTP 和和 dTTP 混合物混合物 (大量大量) 荧光标记的荧光标记的 ddATP, ddGTP, ddCTP 和和 ddTTP (少量少量)测序酶测序酶 末端染色测序反应末端染色测序反应Applied Biosystems PRISM 377(Gel, 34-96 lanes)Applied Biosystems PRISM 3700(Capillary, 96 capillaries)DNA 自动测序仪自动测序仪 三、三、 焦磷酸测序焦磷酸测序 (Pyrosequencing) 焦磷酸测序技术是新一代焦磷酸测序技术是新一代 DNA 序列分析技术，该技序列分析技术，该技术无须进行电泳，术无须进行电泳，DNA 片段也无须荧光标记。片段也无须荧光标记。 焦磷酸测序技术是同一反应体系中由焦磷酸测序技术是同一反应体系中由 4 种酶种酶催化的酶催化的酶级联化