细胞色素P450酶诱导模型

1、细胞色素P450酶诱导模型 摘要细胞色素氧化酶P450是人体内一类参与内源性和外源性化合物代谢的重要代谢酶，代谢活化许多药物，前致癌物，前毒物，和质变剂。大约有60%的药物主要依赖细胞色素氧化酶P450的代谢作用清除的。 本文主要建立了细胞色素P450酶的诱导模型，有望为研究新药提供参考。建立化合物对细胞色素P450酶的诱导的模型时，我们选择了利福平,奥美拉挫和苯巴比妥分别作为1A2,3A4和2B6酶的诱导剂。此模型使用肝细胞来建立的，化合物加入到细胞培养液中，通过LC-MS来从测定代谢产物的变化。同时,我们进行了基因水平的检测,在基因水平上我们检测了化合物对细胞的诱导作用.通过此模型，我们可

2、以直接从LC-MS测定的代谢产物的多少来确定未知的化合物是否对细胞色素CYP450是否有诱导作用。由实验得知，利福平,奥美拉挫和苯巴比妥对1A2,3A4和2B6的诱导能力很强，都超过20倍。前言细胞色素P450(cytochrome,CYP450)是一类以还原态与CO结合后在450nm处具有最高吸收峰的含血红素的单链蛋白质。人体内代谢药物的主要酶就是细胞色素P450超家族(Cytochrome P450 proteins, CYP)，它们是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的（包括大多数临床药物）代谢。P450酶能通过其结构中的血红素中的铁离子传递电

3、子，氧化异源物，增强异源物质的水溶性，使它们更易排出体外。美国的一项研究表明，住院患者的严重不良反应发生率为6.7，因药物相互作用的致死率已排名住院患者死亡原因的第45位1。近20年内，美国IDA先后已将批准上市的数十种新药从市场撤出，其最主要的原因就是出现了严重的药物代谢性相互作用2。诱导药物代谢是药物在代谢过程中诱导CYP450酶的表达或者CYP450酶的功能上调，从而加快药物的代谢速率，影响了临床药效或者引起药物中毒的一种代谢方式。新药对CYP450酶的诱导作用已经越来越受国际医药界的重视，新药对CYP450酶诱导能力评价已经正式成为FDA的标准之一。生物体中的酶分为两种，分别为结构酶和

4、诱导酶，CYP450酶是个很大的家族，其基因就超过了200种，一小部分基因数量稳定在细胞中被持续的转录和翻译，我们称之为结构酶，另一部分酶需要受到化学物质或者激素的刺激才能被表达，我们称之为诱导酶。药物对细胞色素P450产生诱导的主要机制是基因转录水平的提高。绝大部分的CYP450酶的基因转录的增加是通过核受体介导的机制。CYP酶的基因活化主要有三种受体调控：孕烷X受体（PXR）,雄烷受体(CAR)，和芳烃受体（AhR）。【3】正常情况下，核受体与其对应的阻截物结合，保证基因转录水平的稳定性，但是当诱导药物存在时，药物会和受体配基的结合区域结合，并且使阻截化合物解聚，从而促使染色质变质和基因转

5、录。【4】 CYP450酶的家族很大，主要分为三类：CYP1家族，CYP2家族，CYP3家族27,28 。我们在实验中选取了CYP450酶的1A2，3A4和 2B6进行了诱导能力的评价。CYP3A4，CYP1A2和 CYP2B6的诱导分别由PXR，CAR和AhR介导，因此我们对CYP450家族进行的体外诱导实验只需要选取这三个酶就可以了。根据FDA的报道利福平,奥美拉挫和苯巴比妥分别是1A2,3A4和2B6酶强诱导剂，所以我们选取了这三个化合物来进行我们的实验。研究CYP450酶的诱导主要有肝实质细胞培养法，肝切片法，基因重组P450酶系以及肝灌流技术。2 实验方法2.1 主要试剂及器材试剂：

6、化合物（底物，内标和诱导剂）：非那西汀（Phenacetin）和咪达唑仑（Midazolam）和安非他酮（Bupropion），对乙酰氨基酚-d4（Acetaminophen-d4），1'-OH-咪达唑仑-13C3（1'-OH-Midazolam-13C3），利福平（Rifampicin）, 奥美拉挫（Omeprazole）, PBS（磷酸缓冲溶液），DMEM F12购买于西格玛。甲醇，乙腈和醋酸胺是色谱级均购买自美国Sigma-Aldrich公司。甲酸是色谱级购买自美国TEDIA。主要酶体系：人的肝细胞购买于IVT。仪器：样品分析采用API5500： 串联质谱样品分析采用应用

7、生物API5500三重四级杆质谱仪 (安大略，加拿大) 配有电喷雾离子源，接口处连接Waters ACQUITY UPLC® (Waters，美国) 液相系统，液相系统配有二元泵，自动进样器，柱温箱。液相系统和数据采集均由Analyst 1.5.1软件控制，软件来源于美国应用生物公司。2.2 常用试剂的配制（1）磷酸盐缓冲溶液（100mM磷酸钾溶液）配制溶液1:精密称量136.5克磷酸钾，加1L蒸馏水溶解。配制溶液2：精密称量174.2克磷酸二钾，加1L蒸馏水溶解。取40.5ml溶液2和9.5ml溶液1混合，用蒸馏水定容到500ml。测定pH值，调至7.4，于4度冰箱保存。（2）底物

8、的配置CYP底物Stock Con.Final Con.1A2非那西汀10 mM30 M3A4咪达唑仑1.67 mM5 M2B6安非他酮50 mM70 M（3）内标的配置IsoformISStock Conc.Final Conc.1A2对乙酰氨基酚-D410 µM0.1 µM3A41'-OH-咪达唑仑-13C3 10 µM0.1 µM2B6OH-安非他酮-D636  µM0.36 µM (100 ng/mL)2.3细胞培养及药物处理使用的肝细胞购买于IVT，培养液选用DMEM:F12培养基，在5%二氧化碳培养箱中3

9、7°C培养。细胞24孔培养板预处理：在细胞24孔培养板铺上鼠尾胶原，37°C培养箱放置3小时，吸出鼠尾胶原，用PBS清洗细胞24孔培养板，放置-80°C保存。使用前用PBS清洗。从液氮罐中取出人肝细胞，在37°C水浴中快速溶解。用DMEM:F12清洗细胞，计数，肝细胞56x105在DMEM:F12溶液中，培养细胞。化合物配制在DMEM:F12培养基中，连续三日换液（含化合物）后，加入底物，测试底物的代谢产物，从而判定化合物是否对酶有诱导。3.试验结果3.1 酶活 在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后，与阴性对照（以DMSO代替化合物或参照物）相比，通

10、过三种CYP酶（CYP1A2，CYP3A4，CYP2B6）的特异性底物产生的代谢产物的量，来评估化合物对三种CYP酶的诱导作用。试验结果见表1表3。 表1：在化合物或参照物（Omeprazole）与人肝细胞培养72小时后，CYP1A2酶活的变化 Test ArticleConcentration (µM)Fold of inductionDonor 1Donor 1Donor 1Donor 1Donor 1DMSO only-11110.00 Omeprazole25284.218.616.9 0.71 表2：在化合物或参照物（Phenobarbita）与人肝细胞培养72小时后，CY

11、P2B6酶活的变化Test ArticleConcentration (µM)Fold of inductionDonor 1Donor 2Donor 3MeanRSDDMSO only-11110.00Phenobarbital7508845.81148.38 0.80 表3: 在化合物或参照物（Rifampicin）与人肝细胞培养72小时后，CYP3A4酶活的变化Test ArticleConcentration (µM)Fold of inductionDonor 1Donor 2Donor 3MeanRSDDMSO only-11110.00Rifampicin25

12、5.38.111.78.34 0.38 3.2 mRNA表达水平 在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后，与阴性对照（以DMSO代替化合物或参照物）相比，通过三种CYP酶（CYP1A2，CYP3A4，CYP2B6）的mRNA水平的表达，来评估化合物对三种CYP酶的诱导作用。试验结果见表4。表4：在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后，mRNA表达水平的变化EnzymeIsoformFold of Change*Donor 1Donor 2Donor 3MeanRSD1A2Omeprazole22.71 11.04 8.26 14.01 0.55 2B6Phenobarbital17.22

13、4.42 10.44 10.69 0.60 3A4Rifampicin11.79 12.24 18.87 14.30 0.28 *Fold of Change = 2-CTN/A: Not Acquired.3.3在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后，人肝细胞的存活率 在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后，通过CytoTox-Glo试剂盒检测细胞内特异性酶的释放来表征细胞膜的完整性，进而检测细胞的存活率。试验结果见表5。表5：在化合物或参照物与人肝细胞培养72小时后，人肝细胞的存活率 Sample NameConcentration (µM)Cell Viability (%)Donor 1Donor 2Donor 3MeanRSDDMSO only-88.43 92.93 88.64 90.00 0.03 Omeprazole2591.38 90.08 94.99 92.15 0.03 Phenobarbital75091.06 92.06 87.57 90.23 0.03 Rifampicin2592.52 89.26 93.63 91.80 0.02 7/74. 结论：4.1 在参照物与人肝细胞培养72小时后，CYP1A2的参照物Omeprazole，CYP2B6的参照物Phenobarbital和CYP3A4的参照物Rifampicin，在