细胞实验 MTT

1、 细胞生物学实验 利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数量 一、实验目的 1.熟悉掌握细胞传代培养2.学习和掌握细胞生长速率的测定3.学会用MTT法检测细胞的生长状况4.了解MTT法在生物学研究中的应用二、实验原理细胞生长曲线是观测细胞在一代生长期内增殖过程的重要指标，为培养细胞的细胞生物学参数之一。 图一：体外培养细胞的一代生长曲线MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法

2、，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内(OD值在0.7以内)，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。【注】MTT比色法的影响因素1.溶剂溶解甲瓒能力不同；2.培养基中的酚红、血清和PH变化可能影响OD值；

3、3.DMSO溶解能力强，但是可能与残留MTT发生反应，随着时间延长不断加深。（改良方案：SDS+DMSO）；三、实验材料1.实验仪器：超净工作台，CO2 培养箱，荧光显微镜2.实验材料：HeLa细胞，96孔板3.实验试剂：PBS(Ph=7.4)，MTT母液(5mg/mL,溶于PBS)，裂解液（10%SDS-0.01N HCL于室温保存），胰酶，DMEM培养基，血清四、实验步骤1.取生长期的HeLa细胞，用胰酶消化计数，配制细胞悬液浓度为8×104/mL；2.每列都加完全培养基100L（除去第二列），取细胞悬液200L接种到第二列，在第二列取100L接种到第三列，依次类推；最终的细胞浓

4、度见下表；3.检测：弃去旧培养基，加入100L含MTT的培养基（5mg/mL MTT:培养基=1:10）；4.孵育4hr，然后加100L裂解液过夜；5.用酶标仪测OD值，检测波长为570nm；表一：96孔板设计（溶液为200L）123456A无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释B无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释C无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释D无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释E无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释F无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释G无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释H无细胞细

5、胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释【注】第7至11列与第2至6列相同，第12列与第1列相同；五、实验结果及分析实验结果：表二：实验组1 OD值结果123456A-0.0940.1130.0470.2410.033-0.030B-0.0960.1660.0240.3190.1740.111C-0.0870.2880.0250.3060.1920.096D-0.0970.4590.4070.3440.1830.143E-0.0740.5310.0570.3430.1840.163F-0.0740.3860.0000.3960.1910.126G-0.0920.3410.0470.2890.1

6、27-0.015H-0.0500.0300.0310.2980.162-0.138平均值-0.0830.2890.0800.3170.1560.057表三：实验组2OD值结果789101112A0.1660.114-0.0270.056-0.059-0.063B0.3280.7950.0200.018-0.0060.057C0.7190.3360.0210.0550.0020.044D-0.0750.4210.0780.0650.0130.038E0.5350.9480.3010.0320.024-0.046F0.7940.1200.062-0.026-0.025-0.016G0.1260.1

7、280.002-0.060-0.042-0.035H0.358-0.044-0.041-0.072-0.049-0.648平均值0.3690.3520.0520.009-0.018-0.083/倍稀释图一：实验组1的OD平均值曲线图/倍稀释图二：实验组2的OD平均值曲线图结果分析：1、 由图一可以得出我们小组的实验组1的结果并不理想；实验最后测得OD值没有规律，较乱；而且在未加入裂解液之前，在显微镜下观察时，并没有松针，而且细胞有可能被污染；分析原因应该是在接种细胞的时候细胞没有混匀导致有的地方细胞过于密集而死亡；也有可能是在加药或者接种的时候被污染；2、由图二可以看出实验组2的实验结果较为理想；随着接种细胞浓度的降低，OD值也在减少；细胞密度偏大测出的吸光度也会偏大，细胞密度小吸光度也会偏小；另外跟细胞状态也有关系，细胞状态不好的话，吸光度值也会低的；六、实验思考题可以通过哪些措施保证接种细胞时均匀分布？1、 因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加8个孔就混 匀一次，以确保接种的细胞密度在各孔之间完全相同；加样器操作要熟练，尽量避免人为误差；2、 吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，比较容易混匀；吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会