第十四章色谱法的基

1、第十四章第十四章 色谱法的基本原理色谱法的基本原理 14.1 色谱法概述 14.1.1 14.1.1 色谱法的起源和发展色谱法的起源和发展 胡萝卜素(黄色)石油醚+植物色素石油醚CaCO3固定相叶绿素(绿色)叶黄素(黄色)一、色谱法的定义一、色谱法的定义14.1.2 14.1.2 色谱法定义和分类色谱法定义和分类定义：定义：利用利用不同溶质不同溶质（样品）与（样品）与固定相和流动相之固定相和流动相之间的作用力间的作用力（分配、吸附、离子交换等）的（分配、吸附、离子交换等）的差别差别，当当两相做相对移动时两相做相对移动时，各溶质在两相间进行多次，各溶质在两相间进行多次平衡，使各平衡，使各溶质达到

2、相互分离溶质达到相互分离。特点：特点： 高超的分离能力，高超的分离能力，是一种物理化学分析方法是一种物理化学分析方法二、色谱法的重要概念二、色谱法的重要概念固定相流动相色谱柱 1 1、按、按流动相流动相所处的状态分类所处的状态分类 气相色谱气相色谱 - - 用气体作流动相用气体作流动相 液相色谱液相色谱 - - 用液体作流动相用液体作流动相气气固色谱固色谱气气液色谱液色谱液液固色谱固色谱液液液色谱液色谱14.1.2 色谱法的分类色谱法的分类超临界流体色谱超临界流体色谱2 2、按、按固定相使用的形状固定相使用的形状分类分类柱色谱：固定相装在柱管内。柱色谱：固定相装在柱管内。纸色谱纸色谱薄层色谱薄

3、层色谱( (纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱纸色谱和薄层色谱又统称作平板色谱) )3 3、按、按分离过程的物理化学原理分离过程的物理化学原理分类分类 吸附色谱吸附色谱 (L(LS S，G GS)S) 分配色谱分配色谱 (L(LL L，G GL)L) 离子交换色谱离子交换色谱 (L(LS)S) 空间排阻色谱空间排阻色谱 (L(LS)S)14.2 14.2 色谱分离原理色谱分离原理1. 分配系数（分配系数（K）msCCKCs： 被测组分在固定相中的浓度被测组分在固定相中的浓度Cm： 被测组分在被测组分在流动相中的浓度流动相中的浓度14.2.1 14.2.1 分配系数和分配比分配系数和分配比 分配系

4、数意义：分配系数意义：K是热力学常数是热力学常数，K值除了与温度、压力有关值除了与温度、压力有关外，还与被测物、固定相和流动相的性质有关。外，还与被测物、固定相和流动相的性质有关。K值大值大Cs大大停留时间长停留时间长移动速度慢。移动速度慢。若两组分的若两组分的K值相等值相等两个组分不能分离开。两个组分不能分离开。 msCCK 思考：混合组分在色谱法中实现分离的必要条件？思考：混合组分在色谱法中实现分离的必要条件？ 2. 分配比（分配比（k）VVVVmmmmmsssssmncKkKmnc VVms ：相比相比 VVVVmmmmmsssssmncKkKmnc 分配比的意义：分配比的意义：k随随K

5、和和的变化而变化；的变化而变化；k值越大值越大ms越多越多柱的容量大柱的容量大 k又称作又称作容量因子容量因子。k是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参数。是表征色谱柱对被测组分保留能力的主要参数。 色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等。色谱分离过程的特点：不同组分在通过色谱柱时移动速度不等。流动相 BBA空气B A+B A检测和记录A+B+空气进样固定相流动相14.2.2 14.2.2 色谱法分离原理色谱法分离原理14.3 色谱流出曲线一、色谱流出曲线或色谱图一、色谱流出曲线或色谱图 以以检测器对组分的响应信号检测器对组分的响应信号为纵坐标，为纵坐标，流出时间流出时间( (

6、或流或流出体积出体积) )为横坐标作图所得的曲线。为横坐标作图所得的曲线。二、色谱流出曲线构成：二、色谱流出曲线构成： 由由基线基线和和色谱峰色谱峰组成。组成。基线：基线：指仅有流动相通过而没有待测物，检测器指仅有流动相通过而没有待测物，检测器响应信号响应信号随流出时间随流出时间的变化。的变化。色谱峰：色谱峰：在基线上突起的部分，由引入流动相中在基线上突起的部分，由引入流动相中被测物引起的。被测物引起的。色谱图或色谱流出曲线色谱图或色谱流出曲线描述色谱峰三种参数描述色谱峰三种参数峰高峰高( (或峰面积或峰面积) ) 峰的大小峰的大小区域宽度区域宽度 峰的形状峰的形状保留值保留值( (时间时间t

7、 t、体积、体积v) v) 峰的位置峰的位置14.3.1 14.3.1 色谱峰色谱峰高斯分布曲线高斯分布曲线1峰高峰高h2标准偏差标准偏差，0.607h处，拐点处，峰宽正好为处，拐点处，峰宽正好为23峰面积峰面积A A1.065hY1/24半峰宽半峰宽Y1/2 Y1/2=2.3545峰底宽峰底宽Y=4，拐点作切线与基线相交，相交两点间，拐点作切线与基线相交，相交两点间距离为峰底宽距离为峰底宽Y。Y1/2、Y统称为区域宽度统称为区域宽度1 1、描述分析样品中各组分在色谱柱中滞留情况的物理量；、描述分析样品中各组分在色谱柱中滞留情况的物理量；2 2、通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积或时间表示

8、。、通常用将各组分带出色谱柱所需的载气体积或时间表示。14.3.2 14.3.2 保留值保留值保留值意义：保留值意义： 在一定的在一定的固定相固定相和和操作条件操作条件下，任何一种物下，任何一种物质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用质都有一个固定的保留值，故组分的保留值可用于该组分的定性鉴定于该组分的定性鉴定。 特点：特点：1 1死时间死时间t tM M说明：说明：实际上就是流动相通过色谱柱所需要的实际上就是流动相通过色谱柱所需要的时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。时间。或是组分在流动相中所消耗的时间。 t tM M由由色谱柱中流动相体积色谱柱中流动相体积V Vm m与与流动相流速流

9、动相流速决定决定，与，与被测组分被测组分和和固定相固定相无关。无关。 死时间（死时间（t tM M）：）： 从进样开始到柱后，不被固定相吸附或溶解的从进样开始到柱后，不被固定相吸附或溶解的组分出现响应信号极大值时所需的时间。组分出现响应信号极大值时所需的时间。 2. 2. 保留时间保留时间t tR R 定义：定义：从进样开始到柱后从进样开始到柱后 组分出现响应信号极大值组分出现响应信号极大值 时所需时间。时所需时间。说明：说明：组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时组分的保留时间就是组分通过色谱柱所需的时间。即组分在色谱柱内运行的时间。间。即组分在色谱柱内运行的时间。影响因素：影响因素：流流

10、 动动 相相性质、在色谱柱中的体积性质、在色谱柱中的体积Vm和流速和流速固固 定定 相相性质、在色谱柱中的体积性质、在色谱柱中的体积Vs；被测组分被测组分性质性质 3. 3. 调整保留时间调整保留时间（ ）定义：定义：扣除死时间后的保留时间。扣除死时间后的保留时间。说明：说明：组分在固定相中停留的时间组分在固定相中停留的时间。RtRt= RMtt注意：MtttRR4. 4. 流动相的流速流动相的流速 定义：定义：线流速，线流速，u -单位时间流动相所通过的距离单位时间流动相所通过的距离体积流速，体积流速，F -单位时间通过流动相的体积单位时间通过流动相的体积质量流速，质量流速，Fm和和摩尔流速

11、，摩尔流速，Fn) -单位时间通过流单位时间通过流动相的量动相的量Fm和和Fn常称作流量。常称作流量。 无论对于气相色谱还是对于液相色谱，在无论对于气相色谱还是对于液相色谱，在流路的任何一点，流路的任何一点， 质量流速或摩尔流速相等。质量流速或摩尔流速相等。 Fm=Fn 对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同；对于气相色谱，线流速和体积流速可能各处不同； 对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为各处对于液相色谱，线流速可能不一样，但体积流速可视为各处相同。相同。 PRTnV 气体状态方程气体状态方程不同位置处，线流速不同不同位置处，线流速不同气相色谱中柱内平均体积流速的确定气相色谱

12、中柱内平均体积流速的确定c c点处的平均体积流速点处的平均体积流速 cFPRTnV 气相色谱中柱内平均体积流速的确定气相色谱中柱内平均体积流速的确定cFncF为柱内气体的平均摩尔流速为柱内气体的平均摩尔流速 nrrrrrrrrVn R TR TFFttPP为流量计内为流量计内r r处气体的摩尔流速处气体的摩尔流速 nrFF Fc c很难测，且为柱内平均值，很难测，且为柱内平均值，F Fr r易测，求易测，求F Fr r与与F Fc c的关系即可。的关系即可。nccccccccVn RTRTFFttPPnncrFFcrcrrcTPFFTPrRTPFFrrnrPRTnV 柱内平均压力柱内平均压力

13、Pc3iocoo2io12131PPPPPjPP2io3io1321PPjPPcrcrrcTPFFTPr点处载气的压力点处载气的压力Pr Pr = PoPw cowcrroT PPFjFTP3iocoo2io12131PPPPPjPPcowcrroT PPFjFTP压力校正项2io3io1321PPjPP湿度校正项owoPPP rcTT温度校正项5. 5. 死体积死体积V VM M定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需定义：不被固定相保留的组分，通过色谱柱时所需流动相的体积。流动相的体积。 计算：计算：VM = tM cF6. 6. 保留体积保留体积V VR R 定义：从进样开始到柱后出

14、现待测组分响应信号定义：从进样开始到柱后出现待测组分响应信号极大值时所通过的载气体积。极大值时所通过的载气体积。cF计算： VR = tR 注意注意：保留时间：保留时间受流动相流速的影响受流动相流速的影响，保留体积，保留体积与流动相流速无关。与流动相流速无关。7. 7. 调整保留体积调整保留体积定义：定义： 保留体积扣除死体积后的体积保留体积扣除死体积后的体积计算公式：计算公式：MRCRRVVFtV8. 8. 相对保留值相对保留值 r2,1 （选择性因子选择性因子 ）定义：相对保留值 r2,1是指组分2的调整保留值调整保留值与组分1的调整保留值调整保留值之比公式：22221111RRRR2,1

15、RRRRtVtVrtVtV说明：说明： r2,1只与只与柱温和固定相性质柱温和固定相性质有关有关 r2,1越大越大两组分容易分离；两组分容易分离； r2,1 = 1时时两组分不能分开。两组分不能分开。 9. 9. 保留值与容量因子（分配比）的关系保留值与容量因子（分配比）的关系XRLut被测物在色谱柱内的平均线流速被测物在色谱柱内的平均线流速x x为为 流动相在色谱柱内的平均线流速流动相在色谱柱内的平均线流速为为 MLutXmsmnuunnL L为色谱柱长为色谱柱长msmnnn被测物出现在流动相中的几率为被测物出现在流动相中的几率为 x x 与与 的关系为的关系为 色谱柱长是一定的，所以 mM

16、mmsmRsmmm11ntnnnntnnknnXRMutu tmRMsmnututnnRM(1)ttkRMRMMtttktt2211Rs2RM2m2sRR111mMtVKttkVKVttkKKVt色谱过程方程：色谱过程方程：表达了表达了保留时间保留时间与与分配系数或容量因子分配系数或容量因子两个重要两个重要参数的关系。参数的关系。 容量因子越大，溶质的保留时间也越长。容量因子越大，溶质的保留时间也越长。 对于混合物，分配系数不等是分离的前提。对于混合物，分配系数不等是分离的前提。ms11VVKtkttMMR例例14.1 14.1 已知已知V Vs s = 2.0 mL= 2.0 mL，F Fc

17、 c = 50 mLmin= 50 mLmin-1-1，t tR R = 5 min= 5 min，t tM M = 1= 1 min min。求求V VM M，V VR R， ，k k，K K。 RV100mL0 . 2mL504SmVVkKmsVVKk 由mL20050250mL250550mL50150RRMmMVVVVV 解：4115MRttk 从从色谱流出曲线可以得到的信息色谱流出曲线可以得到的信息1 1样品所含最少组分个数样品所含最少组分个数 2 2可以进行定性分析可以进行定性分析3 3可以进行定量分析可以进行定量分析4 4可对色谱柱效能进行评价可对色谱柱效能进行评价总结总结14.

18、4 14.4 塔板理论塔板理论 14.4.1 14.4.1 塔板理论的假设塔板理论的假设1. 柱分成柱分成n段，段，n为理论塔板数为理论塔板数，每段高为，每段高为H，H为塔板高为塔板高度度，柱长为，柱长为L，则，则n=L/H2. 所有组分开始都加在所有组分开始都加在第零号塔板第零号塔板上。上。3. 在每块塔板上被测物在在每块塔板上被测物在两相间平衡是瞬间建立两相间平衡是瞬间建立的。的。4. 流动相是以脉冲式流动相是以脉冲式(塞子式塞子式)进入色谱柱进入色谱柱进行冲洗的，每进行冲洗的，每次恰好为一个塔板体积次恰好为一个塔板体积V。5. 在所有塔板上，在所有塔板上，同一组分的分配系数为常数同一组分

19、的分配系数为常数，即和组，即和组分的量无关。分的量无关。6. 沿色谱柱方向沿色谱柱方向不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散不存在塔板与塔板间被测物的纵向扩散。假定：K=1 Vs/Vm=1 k=1 n=5 进样量 m=1mg 板体积数板体积数（VV）0 01 12 23 34 40 00.51V1V50.250.252V2V0.1250.1250.1250.1250.1250.1253V3V0.06250.06250.1880.1880.1880.1880.06250.06250.0

20、6250.06250.1880.1880.1880.1880.06250.06254 4VV0.03120.03120.1250.1250.1880.1880.1250.1250.03120.03120.03120.03120.1250.1250.1880.1880.1250.1250.03120.0312检测器检测器固定相这一理论得到结果这一理论得到结果1 1分布有一最大值，两边逐渐减小分布有一最大值，两边逐渐减小2 2色谱流出曲线的形状类似于数学上色谱流出曲线的形状类似于数学上的正态分布曲线的正态分布曲线22()212xye正态分布方程为：2R2RR()22Cen VVnmVV C：不同流

21、出体积时的组分浓度：不同流出体积时的组分浓度m：进样量：进样量 VR：保留体积：保留体积n：塔板数：塔板数 V ：流出体积：流出体积将正态分布方程用于色谱流出曲线方程的数学表达将正态分布方程用于色谱流出曲线方程的数学表达式，也称式，也称塔板理论方程塔板理论方程 ： 令：为标准偏差 nVR令：令：m = 1 当当VVR时，时， 22()212RVVC =e则21/ 222212Yccemaxmax则：则：1/ 221/222212ln228YY =2R2()2maxV Vccemax12cc当R1/ 212VVY21maxCC1 / 2220.6938Y 1/22.354Y将1/22.354Y代

22、入RVnR1/22.354VYnR1/ 22.354VnY2R1/ 25.54()VnY由Y1/2 = 2.354 和 Y = 4 可证明Y1/2=0.5885Y22RR25.54()16()(0.5885)VVnYYLHn2R1/25.54()VnY为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板为了准确评价色谱柱效能，宜采用有效塔板数数n neffeff和有效塔板高度和有效塔板高度H Heffeff22RReff1/25.54()16()ttnYYeffeffLHn理论塔板数和有效塔板数关系理论塔板数和有效塔板数关系2222RRRReffRRM16()16() ()()ttttnnYYttt 2ef

23、f()1knnk说明：说明：对于对于n和和neff以及以及H和和Heff， 同一色谱柱，对不同物质是不一样的；同一色谱柱，对不同物质是不一样的； 同一物质，对不同柱子也不一样。同一物质，对不同柱子也不一样。塔板理论的成功与不足塔板理论的成功与不足成功：成功：1 1、导出了色谱流出曲线的数学表达式；、导出了色谱流出曲线的数学表达式；2 2、说明了色谱峰的形状呈正态分布；、说明了色谱峰的形状呈正态分布；3 3、解释了浓度极大点；、解释了浓度极大点；4 4、提出了评价柱效的参数、提出了评价柱效的参数( (n n) )及其计算式及其计算式 不足：不足：1 1、仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；、

24、仅考虑了热力学因素，没有考虑动力学因素；2 2、不能说明影响柱效的因素及谱带扩张的原因；、不能说明影响柱效的因素及谱带扩张的原因；3 3、不能说明流动相流速对柱效的影响，而实验事实、不能说明流动相流速对柱效的影响，而实验事实是流速不同时测得的是流速不同时测得的n ( (或或H) )不同不同 14.5 14.5 速率理论速率理论BHAC uu14.5.1 气相色谱法1 1、填充柱色谱的速率理论、填充柱色谱的速率理论范弟姆特方程范弟姆特方程A A 涡流扩散项，涡流扩散项，B B 分子扩散项系数，分子扩散项系数，C C 传质阻力项系数，传质阻力项系数， 为载气的平均线流速为载气的平均线流速u1 1涡

25、流扩散项涡流扩散项AA = 2dP：填充不规则因子：填充不规则因子dP：填充物颗粒的平均直径：填充物颗粒的平均直径影响因素：影响因素： 填充物颗粒的大小、分布填充物颗粒的大小、分布 色谱柱填充均匀的程度；色谱柱填充均匀的程度；不受影响：不受影响：载气性质、线速度和组分无关。载气性质、线速度和组分无关。减小涡流扩散提高柱效的有效途径：减小涡流扩散提高柱效的有效途径： 使用适当小的颗粒，且颗粒均匀的填充物，并尽使用适当小的颗粒，且颗粒均匀的填充物，并尽量填充均匀。对于空心毛细管柱，量填充均匀。对于空心毛细管柱，A = 0。 A = 2dP2 2分子扩散项分子扩散项Bu分子扩散项系数分子扩散项系数B

26、 ： B = 2 Dg ： 弯曲因子弯曲因子Dg：组分在气相中的扩散系数：组分在气相中的扩散系数(cm2s-1)与填充物有关：与填充物有关： 对于填充柱，对于填充柱， = 0.50.7； 对于毛细管柱，对于毛细管柱， = 1.0。 Dg与组分的性质、载气的性质、柱温和柱压等因素有关：与组分的性质、载气的性质、柱温和柱压等因素有关： 分子量大的组分分子量大的组分Dg小；小； Dg反比于载气分子量的平方根反比于载气分子量的平方根, 故采用分子量较大的载气故采用分子量较大的载气可使可使B项降低；项降低； Dg随柱温升高而增大，而随柱压增大而减小随柱温升高而增大，而随柱压增大而减小。B = 2 Dg3

27、 3传质阻力项传质阻力项 C传质传质：物质因物质因浓度不均匀浓度不均匀而发生的而发生的迁移过程迁移过程称为传质。称为传质。 传质阻力：传质阻力：影响此迁移过程速度的影响此迁移过程速度的阻力阻力称为传质阻力称为传质阻力 传质阻力种类：传质阻力种类：包括气相和液相传质阻力，而传质阻包括气相和液相传质阻力，而传质阻力系数也包括气相传质力系数也包括气相传质阻力系数阻力系数Cg和液相传质阻力和液相传质阻力系数系数CluC = Cg + Cl 气相传质过程气相传质过程气相传质过程是待测组分从气液界面移动到气相内气相传质过程是待测组分从气液界面移动到气相内部而后又移动到气液界面的过程。部而后又移动到气液界面

28、的过程。影影 响：响：Cg与填充物粒度与填充物粒度dp的平方成正比，与组的平方成正比，与组分在载气流中的扩散系数分在载气流中的扩散系数Dg成反比。成反比。解决方法：解决方法：采用采用粒度小的填充物粒度小的填充物和和分子量小的气体分子量小的气体作载气作载气可使可使Cg减小减小,从而提高柱效。从而提高柱效。22pg2g0.01(1)dkCkD对于填充柱：对于填充柱：气相传质阻力系数气相传质阻力系数液相传质过程液相传质过程液相传质过程是指待测组分从气液界面移动到液相内部，发液相传质过程是指待测组分从气液界面移动到液相内部，发生质量交换以达到分配平衡，然后又返回气液界面的传质过生质量交换以达到分配平衡

29、，然后又返回气液界面的传质过程。程。2fl2l23 (1)dkCkD影影 响：响：固定相液膜厚度（固定相液膜厚度（df） 和组分在液相和组分在液相中的扩散系数（中的扩散系数（Dl ）。）。解决方法：解决方法：减小液膜厚度减小液膜厚度df，增大组分在液相中，增大组分在液相中的扩散系数的扩散系数Dl，均可提高柱效。，均可提高柱效。 液相传质阻力系数液相传质阻力系数速率理论方程速率理论方程填料性质：填料性质：填料颗粒均匀程度、填料颗粒大小填料颗粒均匀程度、填料颗粒大小填充情况填充情况：填料在色谱柱中填充均匀程度填料在色谱柱中填充均匀程度流动相流动相：流动相种类和流速流动相种类和流速固定相固定相：固定

30、液厚度固定液厚度222gpfp22gl20.012= 2 +(1)3 (1)DddkkHdukDkDu公式说明影响公式说明影响n或或H的因素的因素结论：范弟姆特方程对色谱分离条件的选择具有指导意义结论：范弟姆特方程对色谱分离条件的选择具有指导意义14.6 14.6 分离度分离度( (Rs) )14.6.1 14.6.1 定义定义Rs是相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底是相邻两组分色谱峰保留值之差与两个组分色谱峰峰底宽宽Y1和和Y2总和的一半的比值总和的一半的比值 2121RRRRS12122()1()2ttttRYYYY衡量色谱图中相邻两峰分离程度衡量色谱图中相邻两峰分离程度意义意义2121RRRRS12122()1()2ttttRYYYY热力学因素（两峰离开距离）热力学因素（两峰离开距离）动力学因素（两峰宽动力学因素（两峰宽窄）窄）不同分离度下色谱峰示意图不同分离度下色谱峰示意图通常用通常用Rs = 1.5 作为相邻两色谱峰完全分开的指标作为相邻两色谱峰完全分开的指标 R=1.5：达：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。（相邻两峰完全分离的标准）。 R=0.75 R=1 R=1.514.6.2 14.6.2 色谱分离基本方程式色谱分离基本方程式假定 ， 则 12YY212121RRRRR