灯盏花查尔酮合成酶基因表达和灯盏乙素含量关系探究

1、灯盏花查尔酮合成酶基因表达和灯盏乙素含量关系探究摘要目的：灯盏花的有效成分灯盏乙素是一种 具有显著药理活性的黄酮类化合物，目前仍缺乏对其合成途 径的相关认识。查尔酮合成酶(chs)是黄酮类生物合成的 一个关键酶，该研究旨在通过研究chs表达水平与灯盏花中 各组织灯盏乙素含量的变化规律，阐明该基因的表达模式与 灯盏乙素含量之间的关系。方法：通过rt-pcr及race方法从灯盏花中克隆chs基因全长，利用荧光定量pcr方法检测该基因在灯盏花各组织 中的表达量，采用hplc分析各组织中灯盏乙素的含量。结果：序列全长1 270 bp,编码405氨基酸，该基因 dna序列与菊科植物的同源基因相似性在80

2、%左右，荧光定 量显示chs在叶中表达量最高，远高于根、茎和花；hplc发 现灯盏乙素在叶中含量最高，其次是花和茎，而在根中未检 测到。结论：相关性分析表明chs相对表达量与灯盏花不同部 位灯盏乙素含量间呈正相关关系(0.761, p 1.5灯 盏花不同部位灯盏乙素含量测定krosam订s c18色谱柱(4. 6 mmx250 mm, 5 pm),参照药典采用的流动相为甲醇-0. 1% 磷酸溶液(40 : 60),流速0. 9 ml min-1,检测波长335 nm,柱温30 °c,进样量10 ulo对照品溶液的制备参照药典制 备对照品溶液，用以建立灯盏乙素标准品的线性关系。样品 待

3、测液的制备参照2005年版药典中供试品溶液的制备过程。2结果 2. 1灯盏花全长chs的克隆及特征分析 对总rna进行反转录成cdna,进行pcr扩增，再用1%的琼脂糖电泳检测, 获得约1 000 bp的条带，与目标片段大小相符。经过克隆 测序，并采用内部片段设计反向引物进行卍race,克隆测 序后经dnastar软件包拼接，获得chs基因全长，序列长度为1 237 bpo与刘成洪已克隆测得的灯盏花chs序列比对,一致性高达94. 2%,不是同一个基因,因此，推测灯盏花中应该存在2个或2个以上的chs基因，属于同一基因家族, 进一步印证了前人的基因组杂交实验结果。比对分析发现, 其与菊科植物同

4、源性较高（图1）。2.2灯盏花不同部位chs的表达量分析与不同部位灯盏乙素含量的关系 本研究通过对chs和18s rrna进行溶解曲线分析，查尔酮合成酶基因的溶解曲线呈现单峰、且出峰位 置在退火温度处，据此可以初步确定发出荧光的片段是目标 基因序列的扩增产物，即实验结果比较可靠。由此表明实验 研究采用的荧光定量pcr引物能进行特异性扩增，能用于灯 盏花chs基因的荧光定量研究得到可靠的结果。以18s rrna作为内参基因用实时荧光定量pcr检测各 个部位的表达情况，结果显示查尔酮合成酶基因在根、茎、 叶、花4个部位都有表达，表达存在一定的差异性。从 threshold值，可初步得到在灯盏花中g

5、ot-ct值比较有根 茎花叶(即 29. 54828. 70425. 85225. 008)。因此灯盏 花4个部位的平均表达量的关系为叶花茎根。chs基因在 茎中的相对表达量是根的2.55倍，花中表达量是茎的4. 73 倍，叶中表达量是花的6. 15倍；且叶中表达量最高，远高 于根和茎。将不同部位的chs表达量(表1)与对应部位灯盏乙素 含量作为2个变量，进行相关性分析，得出相关系数为 (r=0. 761, p 3马君兰，李成，魏颖，等.异黄酮 的生物合成途径及其调控j.东北农业大学学报，2007, 38(5) ： 692.4 kreuzaler f, ragg h, fautz e, et

6、al.uv-induction of chaicone synthase mrna in cell suspension culture of petroselinum hortense j proc natl acad sci usa, 1983,80 (9)： 2591.5 lamb c j, law ton m a, dron m, et al. signaland construetion mechanisms for activation of plant defenses against microbial ottack j cell,1989,56 (2)： 215.6 fark

7、as l, meze y, vandor g, et al. notiz fiberdiestruktur von sorbifolin, ladanetin and ladaneinj chem ber, 1971,104：2646.7 刘成洪.查尔酮合成酶等黄酮代谢基因的克隆及短 夢飞蓬遗传转化研究d上海：第二军医大学，2005.8 han y y, ming f, wang w, et al. molecularevolution and functional specialization of chalcone synthase super family from phaenopsis

8、 orchidj. genetica, 2006,28 (1)：429.9 durbin m l, leam g h, huttley g a, et al.evolution of the chaicone synthase gene family in the genus ipomoeaj proc natl acad sci usa, 1995,92：3338.10 durbin m l, mccaig b, clegg m t. molecularevolution of the chaicone synthase multi gene family in the morning gl

9、ory genomej plant mol biol,2000,42 (1)：79.11 杨继，顾红雅.查尔酮合酶超家族基因重复和分化的式样j.科学通报，2006,51 (7)：745.12 杨生超，张雪峰，张丽梅，等.灯盏花最佳采收期研究j中国中药杂志，2008,33 (23)：2744.13 ei-ichiro f, kengo k, shin-ich让ok, et a 1. flower color modulations of toernia hybrida bydownregulation of chaleon sysnthase genes with rna interfernee

10、 j. j biotechnol, 2004,111：229.14诸姮，胡宏友，卢昌义，等植物体内的黄酮类化 合物代谢及其调控研究进展j厦门大学学报：自然科学 版,2007, 46 (增刊 1)： 136.relationship between expression of chalcone synthase gene (chs) andscuteliarin content in erigeron breviscapusliu tao, mu lan, liang yan-li, wang jian-jun, yang sheng-chao*(yunnan research center o

11、n good agricultural practice for dominant chinese medicinal materials,yunnan agricultural university, kunming 650201, china)abstract objective： scutellarin from erigeron breviscapus is a flavonoid with remarkable pharmacological activity， whose route of biosynthesis is still fully clear. chaicone sy

12、nthase (chs) is the key enzyme regulating flavonoids biosynthesis, and the aim of t his st udy is to explain the relationship bet ween patterns of the gene expression and scutellarin content through stu dying chs gene expression pat terns combinedwith scutellarin content in various parts of e brevis

13、capus. met hod： through rt-pcr and race, the full length of chs was cloned and analyzed by fluorescent quantitative pcr. the scutellarin content in tissues was analyzed by hplc resuit：the full-length genesequence was 1 270 bp, encoding 405 amino acids software analysis found that the dna sequence was 80% similarity with compositae plant homeobox gene fluorescence quantitative analysis showed that chs had the highest expression level in leaves, far higher than that in root, stem and flower. hplc analysis showed that the scutellarin was the highest in leaves , followed by the