D值是指在一定温度下

1、D值是指在一定温度下，杀灭90%微生物（或残存率为10%）所需的灭菌时间。在一定灭菌条件下，不同微生物具有不同的D值；同一微生物在不同灭菌条件下，D值亦不相同。因此D值随微生物的种类、环境和灭菌温度变化而异。 Z值是指灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度或在相同灭菌时间内，杀灭99%的微生物所需提高的温度。 F值为在一定温度（T）下，给定Z值所产生的灭菌效果与在参比温度（T0）下给定Z值所产生的灭菌效果相同时，所相当的灭菌时间，以min为单位。F值常用于干热灭菌。 F值的数学表达式如下：式中，t为测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为0.51min，T为每个时间间隔t所测得被灭菌物温度，T0

2、为参比温度。 F0值为一定灭菌温度（T）下，Z为10时所产生的灭菌效果与121，Z值为10所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（min）。也就是说，不管温度如何变化，t分钟内的灭菌效果相当于在121下灭菌F0 分钟的效果。 在湿热灭菌时，参比温度定为121，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为微生物指示菌，该菌在121时，Z值为10。则：显然，即把各温度下灭菌效果都转化成121下灭菌的等效值。因此称F0为标准灭菌时间（min）。F0目前仅应用于热压灭菌。干热灭菌法系指物品于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中、利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品的灭菌，如玻璃器具

3、、金属制容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。 干热灭菌条件一般为160170×120min以上、170180×60min以上或250×45min以上，也可采用其它温度和时间参数。总之，应保证灭菌后的产品其SAL10-6。干热过度杀灭后产品的SAL应10-12，此时物品一般无需进行灭菌前污染微生物的测定。250 45min的干热灭菌也可除去无菌产品包装容器及有关生产灌装用具中的热原物质。 采用干热灭菌时，被灭菌物品应有适当的包装和装载方式，保证灭菌的有效性和均一性。 干热灭菌法验证与湿热灭菌法相同，应进行热分布试验、热穿透试验、生物指示剂验证试验或

4、细菌内毒素灭活验证试验。以确认灭菌柜中的温度分布符合设定的标准、确定最冷点位置、确认最冷点标准灭菌时间（FH）能达到设定标准并达到SAL要求。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。细菌内毒素灭活验证试验是证明除热原过程有效性的试验。一般将不小于1000单位的细菌内毒素加入待去热原的物品中，证明该去热原工艺能使内毒素至少下降3个对数单位。细菌内毒素灭活验证试验所用的细菌内毒素一般为大肠杆菌内毒素（Escherichia coli endoxin）。验证时，一般采用最大装载方式。 注射剂2008新法规解析及应对方案系列培训班注射制剂

5、无菌保证工艺技术要求的探讨注射制剂无菌保证工艺技术要求一、 前言二、注射剂基本技术的要求三、无菌保证工艺研究与验证要求 四、无菌药品生产关键工艺的法规要求 (以最终湿热灭菌药品工艺为例)一、前 言1970年1975年，美国因输液污染所导致的并发败血症事件有400多起，这在美国国内引起强烈的反响。FDA从1975年开始进行了深入、广泛的调查，发现这些事件并不是出于企业违规生产，而是整个生产体系中的不稳定因素所致。 此后，FDA于1976年首次将验证列入GMP。承认在无保证系统中，过程控制优于结果检验。 30多年过去了，注射剂染菌所致的药难事件降临我国，“欣弗”事件使得无菌制剂的无菌保障问题成为公

6、众关注的焦点。 -无菌检查的局限性-研究无菌保证的途径面临的主要问题剂型选择不合理 无菌保证工艺选择不合理无菌保证工艺研究不全面无菌保证工艺缺乏必要的验证GMP与发达国家要求还存在差距 整顿和规范药品研制、生产、流通秩序工作方案（国食药监办2006465号）要求:严格审评审批化学药品注射剂、中药注射剂和多组分生化注射剂等安全性风险较大的3类品种。二、 注射剂基本技术的要求审评审批要求:一、国家局已受理但尚未批准注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂应参照技术要求进行研究。二、已经批准注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂也应参照技术要求进行相关研究，并在申报再注册时提供相关研究资料。三、对

7、已上市化学药品注射剂、多组分生化药注射剂进行仿制、改变剂型或者改变给药途径研究时，研究者应当慎重考虑已上市品种的研究基础。以化学药品注射剂为例:一、化学药品注射剂剂型选择的必要性、合理性二、化学药品注射剂规格的合理性、必要性三、化学药品注射剂原、辅料质量控制及来源四、化学药品注射剂处方及制备工艺合理性、可行性研究，特别是灭菌工艺的选择及验证研究、工艺稳定性研究等五、化学药品注射剂质量研究及质量标准制订 六、化学药品注射剂稳定性研究 七、化学药品注射剂非临床安全性评价的技术要求 八、化学药品注射剂临床研究技术要求 九、仿制化学药品注射剂的技术要求 十、化学药品注射剂说明书和标签内容的技术要求 本

8、讲座主要探讨无菌保证工艺研究及评价包括： 制备工艺的选择 工艺参数的确定 工艺的验证 注射剂灭菌工艺及其验证三、无菌保证工艺研究与验证要求1. 最终灭菌产品的无菌保证水平规定为:微生物污染概率不超过百万分之一2.采用无菌生产工艺的产品:其无菌保证水平为微生物污染概率不超过千分之一3.与产品无菌保证相关的影响因素环境厂房、设备原材料（原辅料、包装材料）无菌保证工艺生产过程控制人员卫生4.灭菌方法选择按欧盟1999年8月正式开始执行灭菌方法选择的决策树决策树的作用是在考虑各种复杂因素的情况下辅助选择最佳的灭菌方法凡是可以最终灭菌的产品务必要最终灭菌2.3. 决策树越往下，风险越大需要提供的必要证据

9、越多5.基本原则:无菌产品应在灌装到最终容器后进行最终灭菌（首选）如因产品对热不稳定不能进行最终灭菌时，可采用最终灭菌方法的替代方法-过滤除菌和/或无菌生产工艺（退而求其次）同时明确如下要求：无菌药品生产企业，首先应根据特定的处方选择最佳的灭菌方法，然后再选择包装材料使用热不稳定的包装材料不能作为选择无菌生产工艺的理由因其他因素选择的包装容器不能进行最终灭菌，药品生产企业仍有责任不断寻找可接受的替代容器，使得产品可以在可接受的时间范围内采用最终灭菌的方法 任何商业考虑均不能作为不使用具有最高无菌保证水平的最终灭菌方法的理由常用的灭菌方式及其无菌保证水平1、过度杀灭法 微生物残存概率10-62、

10、残存概率法 微生物残存概率10-63、无菌生产工艺 无菌保证一般只能达到10-3水平4. 最终灭菌工艺的验证要求最终灭菌工艺：过度杀灭法（ Fo12） 残存概率法（8 Fo12）目标：灭菌后的微生物残存概率10-6 过度杀灭设计方法：一种灭菌设计方法，只需要最少的关于产品生物负载的信息。最差条件的生物负载猜测用来确定所产生的杀灭力需要获得灭菌物上的PNSU为10-6。在使用这个方法时，确效计划必须证明FBIO和FPHY都大于12分钟。5. 残存概率法：一种灭菌设计方法，当所产生的杀灭力需要达到PNSU为10-6时，以（灭菌物品上或内的）生物负载的特性和产品对热的敏感度为基础。应产品而定的设计方

11、法工艺验证要求：过度杀灭法和残存概率法均应进行工艺验证 验证内容：空载热分布 满载热分布 热穿透试验 微生物挑战试验（残存概率法）灭菌前微生物污染水平-数量和耐热性 -过程控制6. 热力灭菌的动力学原理微生物耐热参数 （D值）温度系数 Z值FT 值 T灭菌时间F0 值标准灭菌时间无菌保证值（SAL）灭菌率L对数规则：Arrhenius 质量作用定律 湿热灭菌的对数规则始于1921年Bigeow发表的论文-用对数规则阐述灭菌工艺过程，他认为，灭菌过程可以用阿伦尼乌斯的一级反应式来描述。根据质量作用定律，在恒定温度及保持其它条件不变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于t0时原有的数目，即：

12、dN/dtK(N0Nk) 式中：N0为t0时，存活的微生物数； Nk为t时被杀灭的微生物数； N为t时存活的微生物数。由此得出，灭菌时微生物的死亡遵循对数规则。7. 微生物存活数与灭菌时间关系图8. 微生物耐热参数（D值）:D值是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90%所需要的时间（分钟）。9. 灭菌温度系数（Z值）: Z 值系指使某一种微生物的D 值变化一个对数单位，灭菌温度应升高或下降的度数. 在没有特定要求时 : 湿热灭菌条件下Z值通常取10； 干热灭菌条件下Z值通常取20； 干热去热原时Z值通常取54。FT 值T(): 灭菌时间FT 值指T()灭菌值，系指一个给定Z

13、 值下，灭菌程序在温度T()下的等效灭菌时间。 FTDT×lgN式中:DT 为在T()下微生物的D 值；lgN 为T()下灭菌程序使微生物数下降的对数单位数。F0值: 标准灭菌时间（用于湿热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在121下的等效灭菌时间（分钟）。FH值: 标准灭菌时间（用于干热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在170下的等效灭菌时间（分钟）。灭菌率L： L 指在某一温度T()下灭菌lmin 所获得的标准灭菌时间。L=10 (Ti-TR) /Z Ti灭菌温度 TR标准参照温度 Z 微生物死亡率常数10.11. 微生物挑战试验微生物挑战试验 生物指示剂-简称为BI（biolog

14、ical indicator）:是对特定灭菌工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，适用于制备生物指示剂的微生物多为芽胞类细菌，这是因为，除辐射灭菌外，芽胞类细菌比常规的生长态微生物对灭菌工艺具有更强的耐受性。生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。12. 微生物挑战试验 所谓湿热灭菌工艺的生物指示剂微生物挑战试验，系指将一定量已知D值的耐热孢子接入被灭菌的产品中，在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能赋予产品所需的SAL 为106而进行的试验及评价过程。13. 微生物挑战试验 USP和BP对这方面有专门的论述

15、。一般说来，对生物指示剂选择的原则性要求是： 孢子（菌株）稳定 耐热性强于被灭菌物品中常见的污染菌 系非致病菌 易于培养，孢子萌发率要在90%以上 有效期长 保存及使用方便 安全性好14. 微生物挑战试验 湿热灭菌工艺验证用生物指示剂的来源主要有两类: 一类是采用标准生物指示剂，这类生物指示剂可从市场购买； 另一类需用从日常生产污染菌监控分离出的最耐热微生物孢子制备，并测得相关参数（最佳生长条件、耐热性等）后方可使用。 15. 湿热灭菌工艺验证中常用的生物指示剂 菌 种 名 称常规D121值/min嗜热脂肪芽胞杆菌 Bacillus stereatherno philus1.53.0枯草芽胞杆

16、菌 Bacillus subtilis ATCC52300.30.7凝结芽胞杆菌 Bacillus coagulans0.40.8梭状芽胞杆菌 Clostridium sporogenes0.40.8例: 国产非治病性嗜热肪芽胞菌芽胞（ATCC 7953） D值-D121值1.74存活时间- 121oC饱和蒸汽下, 存活时间不 少于3.9分钟死亡时间- 121oC饱和蒸汽下, 死亡时间不 少于19分钟孢子量- 5×105-6cfu/支16使用方法: 将生物指示剂和被灭菌物品一起放置在灭菌柜（锅）内，上、中层、中央和排气口（冷点处）灭菌后取出，然后直接置于56 60 oC培养24 48

17、小时，并另取一支未经灭菌生物指示剂一起培养，作为阳性对照。结果判断: 根据颜色判断灭菌效果，培养后全部保持紫色灭菌合格。若由紫色变为黄色判为灭菌不合格。对照管应紫变黄色为该指示剂有效。例: 进口3MTMATTESTTM (1262) 蒸汽灭菌生物培养指示剂(嗜热脂肪杆菌芽胞菌片) 在121饱和蒸汽条件下，存活时间大于或等于5分钟，杀灭时间小于或等于15分钟。 灭菌完毕，取出生物指示剂后至少冷却10分钟以上，方可挤破生物指示剂内安瓿。否则有可能导致安瓿的碎片伤人。 只有对照管为阳性，其生物结果才算有效。使用方法1、将压力蒸汽灭菌生物培养指示剂放于一标准测试包中；2、按照国家规范，分别将测试包放于

18、锅内不同位置；3、灭菌完毕，取出生物指示剂；4、挤破内含的安瓿，与一支对照管一起放于56培养锅培养；5、48小时后，阅读结果。微生物挑战试验挑战试验合格标准 生物指示剂的选用应构成挑战性的必要条件：可用药典，如USP<1035>中规定的生物指示剂；对存活概率灭菌程序的产品而言，应当强调，所用生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的耐热性，生物指示剂的用量也应大于产品中该污染菌的水平。 经生物指示剂验证后，应能证明在设定的F0条件下，产品的无菌保证水平低于10-6。微生物挑战试验方案制订 制订验证方案时，应当综合考虑相关法规要求、灭菌热分布及热穿透试验数据、产品的热稳定性、日常生产

19、监控中所获得的灭菌前产品中的微生物污染水平和污染菌的耐热性数据。方案还包括验证记录的各种表格。微生物挑战试验湿热灭菌程序通常分为两类： 过度杀灭程序（Overkill Design Approach） 残存概率程序（Product-Specific Design Approach ）微生物挑战试验挑战试验(生物指示剂验证试验 ): 生物指示剂的装载 灭菌 检查和培养 结果评价 验证试验的频率 微生物挑战试验 作为一项生物挑战性试验，尽管生物指示剂验证不能替代物理验证，但它能如实反映灭菌工艺条件对微生物的杀灭效果，从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要求。生产指示剂在试验中扮演

20、了各种可能因素造成的产品中的“污染菌”的角色，以这种方式进行的验证更切合实际，更能说明所设定的灭菌程序是否安全。微生物挑战试验 对热稳定性很好的产品而言，通常采用过度杀灭程序，该程序能赋予产品足够大的安全系数，使在121下D值约为1.0min的细菌孢子至少下降12个对数单位。在过度杀灭程序的一半时间时，可使该孢子至少下降6个对数单位。由于杀灭微生物孢子（生物指示剂）的灭菌条件极为苛刻，因此，从灭菌程序的标准灭菌时间F0来看，毋须担心产品灭菌后的无菌保证问题。微生物挑战试验 并不是所有的灭菌程序都可进行生物指示剂验证。有些产品的热稳定性相当差，灭菌温度仅能控制在100左右，整个灭菌程序的F0值还

21、不到1min，对此类程序进行生物指示剂验证就没有太多的意义。此类产品的无菌保证水平主要是通过无菌生产工艺来实现，灭菌仅能作为提高产品无菌保证水平的手段。微生物挑战试验 WHO GMP中强调，化学或生物指示剂可用于灭菌过程的监控，但不得代替物理监控（温度、时间）。 FDA均认为生物指示剂验证并不能取代物理验证，这是由生物指示剂验证的复杂性所决定的。Dry heat sterilization D value isF值为在一定温度（T）下，给定Z值所产生的灭菌效果与在参比温度（T0）下给定Z值所产生的灭菌效果相同时，所相当的灭菌时间，以min为单位。F值常用于干热灭菌。 F值的数学表达式如下： 式

22、中，t为测量被灭菌物温度的时间间隔，一般为0.51min，T为每个时间间隔t所测得被灭菌物温度，T0为参比温度。Z值是指灭菌时间减少到原来的1/10所需升高的温度或在相同灭菌时间内，杀灭99%的微生物所需提高的温度。1.将指示剂与待灭菌的物品一同放入灭菌器内，一同灭菌。2.灭菌结束后，取出指示剂，待冷却（约15分钟）后，将盖子按下以密封塑料管。3.用所提供的工具挤压塑料管，使安培瓶破裂，培养基溢出，与纸片接触。4.置于56摄氏度培养，定时观察生长情况5.48小时内出结果D值是指在一定温度下，杀灭90%微生物（或残存率为10%）所需的灭菌时间。在一定灭菌条件下，不同微生物具有不同的D值；同一微生

23、物在不同灭菌条件下，D值亦不相同。因此D值随微生物的种类、环境和灭菌温度变化而异。F0值为一定灭菌温度（T）下，Z为10时所产生的灭菌效果与121，Z值为10所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（min）。也就是说，不管温度如何变化，t分钟内的灭菌效果相当于在121下灭菌F0 分钟的效果。 在湿热灭菌时，参比温度定为121，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为微生物指示菌，该菌在121时，Z值为10。则：显然，即把各温度下灭菌效果都转化成121下灭菌的等效值。因此称F0为标准灭菌时间（min）。F0目前仅应用于热压灭菌。2、什么是化学灭菌法，分为哪几类，有何应用特点？ 答：化学灭菌法系指用化学药品杀死微生物的

24、方法。 化学灭菌法分为：气体灭菌法：有环氧乙烷、臭氧、过氧乙酸、甲醛、丙二醇、乳酸等。以环氧乙烷最为常用。气体灭菌法用于塑料容器、玻璃制品、金属制品等表面，设备表面，室内空气的灭菌，也可用于包装纸箱，注射针、筒，衣着敷料，纸或塑料包装的药物的灭菌。化学灭菌剂灭菌法：常用的有0.10.2的新洁尔灭溶液，2左右的酚或甲酚皂液，75的乙醇液等。主要作为物体表面，无菌室墙面、地面、台面等的消毒。17、物理灭菌法可分为哪几类，各有何应用特点？ 答：物理灭菌法可分为干热灭菌法、湿热灭菌法、过滤灭菌法。射线灭菌法。 1)干热灭菌法是一种利用干热空气进行灭菌的方法。分为火焰灭菌法和干热空气灭菌法，火焰灭菌法适于耐火焰材料的灭菌，如金属、玻璃及瓷器等。干热空气灭菌法适于耐高温的玻璃器具、金属容器、耐高温的药物粉末及不允许湿气穿透的油性物质(如油脂性软膏基质、注射用油等)的灭菌，不适于橡胶、塑料及大部分药品。 2)湿热灭菌法分为热压灭菌法、流通蒸气灭菌法、煮沸灭菌法和低温间歇灭菌法。热压灭菌法时湿热灭菌中最可靠的方法，适用于耐热压灭菌的药物、玻璃器皿、金属容器、瓷器、橡胶塞、滤膜过滤器、医院手术用品等的灭菌。流通蒸气灭菌法与煮沸灭菌法均不能保证杀死所有的耐热芽孢，适用于必须加热灭菌，但不耐高温的药物。低温间歇灭