融合蛋白hsp70egfp的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用

1、融合蛋白hsp70egfp的表达、纯化及其在树突状细胞内化抗原中的应用【摘要】目的：研究树突状细胞(dcs)对热休克蛋白70 (hsp70)融合蛋白的内化作用.方法：首先原核表达并分离纯化 hsp70和增强型绿色荧光蛋白(egfp)的融合蛋白hsp70 egfp.实 验中所用dcs来源于人外周血.内化实验分3组进行：将1, 2组dcs 分别与融合蛋白hsp70egfp和蛋白egfp孵育30 min；第3组先将dcs与hsp70孵育30 min,再与hsp70 egfp孵育30 min.之后 将3组dcs转至37£孵箱内，培养0.5, 1, 2和24h,应用流式细 胞仪检测含hsp70

2、 egfp或egfp的dcs数量.应用il 12 eli spot法检测hsp70 egfp等抗原促进dcs分泌il 12的效果.结 果： 成功获得了重组蛋白hsp70 egfp,壯约为97 000, hsp70egfp表达量占总蛋白的35. 7%.纯化后的融合蛋白hsp70 egfp 溶液经紫外线灯照射时发出鲜绿色的荧光.流式细胞仪检测结果 显示在37°c孵育0. 5 h后，hsp70 egfp孵育的dcs组阳性率为 63. 3%,其余两组为阴性.在371孵育1, 2和24 h后，3组阳性率 均大于80. 0%. il 12 eli spot检测结果显示，在刺激dcs活化 及分泌i

3、i, 12的水平上，hsp70 egfp与脂多糖(lps)之间的差 别无统计学意义(p&gt；0. 05),而hsp70 egfp的活化dcs能力明显 高于egfp (p=0. 001).结论： 受体介导的吞噬作用在dcs内化 hsp70 egfp的初始阶段起主要作用，随孵育时间的延续，吞饮作 用占主要地位.hsp70 egfp可促进dcs分泌特征性细胞因子il12.【关键词】吞噬作用；受体介导；树突细胞；重组融合蛋白质类; 热休克蛋白质70；绿色荧光蛋白质类热休克蛋白家族在肿瘤免疫中发挥着免疫佐剂的功能，对开发 肿瘤疫苗具有重要意义.许多研究采用标记的热休克蛋白观察hsp 肽复合物在

4、抗原递呈细胞(antigen presenting cell, apc)上的 呈递过程，发现apc表面存在hsp受体1-2.有研究发现，gp96 融合蛋白与受体结合后，可以激活树突状细胞(dendritic cells, dcs)分泌il 12和tnf a ,增强其抗原递呈能力3而对热 休克蛋白70 (heat shock protein, hsp70)融合蛋白在抗原递呈细 胞上的递呈过程的研究报道较少.我们设计了 hsp70和具有示踪功 能的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, egfp)的融合蛋白hsp70 egfp,以探讨dcs内化

5、外源性抗原的方 式及不同抗原对dcs的活化效果.1材料和方法1. 1材料新鲜全血由健康志愿者提供；质粒pires2 egfp （美国 clontech公司）；原核表达载体pet28a（+） hsp70由第四军医大学 病理学教研室陈广生博士构建；ni nta his. bind树脂（美国 novagen公司产品）；rhil 4, rhil 2 （美国r&amp； d生物工程 公司产品）；rhgm csf由厦门特宝生物工程公司生产；鼠抗人 mcabcdla, cd80 和 hla dr （美国 sigma 公司）；羊抗鼠 igg fitc （武汉生物制品公司）；人il 12 eli spo

6、t系统（法国diaclone 公司产品）；蛋白hsp70, mage1由第四军医大学病理学教研室惠赠； 蛋白egfp的制备按文献3的方法进行.1. 2方法1.2. 1载体的构建根据egfp的基因序列，设计引物，用pcr技术从质粒pires2egfp 中扩增 egfp,上游引物为：5 cct gag ctc atg gtg agc aag ggc gag gag 3，,下游引物为：5 gcg ctc gag tta ctt gta cag ctc gtc cat g 3，分别包含了 saci 和 xhol 的内切酶 位点（划线部分）.将egfp基因克隆到pet28a（+） hsp70原核表达 载

7、体上，与hsp70基因融合，转化e. coli dh5ci宿主菌，挑取单克 隆菌落，提取质粒进行酶切鉴定，酶切产物进行10 g/l琼脂糖凝胶 电泳.将重组质粒转化入e. coll bl21(de3),用卡那霉素筛选.培 养含有hsp70 egfp融合基因的bl21大肠杆菌至对数生长期，加入 iptg至终浓度0. 1 mmol/l, 4°c诱导表达1218 h,收菌.sds page分析融合蛋白的表达.1. 2. 3hsp70egfp融合蛋白的分离与纯化用 50 mmol/l 磷酸缓冲液+300 mmol/l nacl, ph 8. 0,充分 悬浮细菌，冰浴、超声裂解细菌，离心收集上清

8、变性蛋白.用22 u m滤膜过滤，ni离子亲和层析柱层析，250 mmol/l咪吐溶液洗脱， 收集洗脱峰.sds page分析纯化蛋白.1.2.4树突状细胞的培养采用文献4的方法分离、诱导及分化外周血中的dcs.在 培养的不同阶段收集悬浮细胞，在光镜下观察细胞的形态，用流式细 胞仪检测dcs表型.1.2.5内化实验实验分为三组，每组含1 x106 dcs,孵育蛋白浓度为100 mg /l. 将1, 2组dcs分别与egfp和hsp70 egfp于4°c孵育30 min；第 3组dcs先与hsp70在4° c孵育30 min,洗涤3遍，再将dcs与hsp70egfp在4

9、76;c孵育30 min.之后将三组dcs转至37°c, 50 ml/l c02 孵箱内，分别培养0.5, 1, 2和24h流式细胞仪检测胞内含egfp 的dcs数量，阴性对照组除孵育蛋白为mage1外，其余各项同1, 2 组.1.2. 6eli spot 检测用人 il12 eli spot 系统(human il 12 eli spot system) 检测活化成熟后释放il 12的dcs细胞频数.依刺激物不同，分别 为：1 mg/l lps； 95°c 灭活 10 min 的 1 mg/l lps； 10 mg/l hsp70egfp； 10 mg/l egfp；无刺

10、激物.实验分5组进行，每组设3个 复孔，加入培养56 d的1x105 dcs作为效应细胞.eli spot 检测按照试剂盒使用说明进行.统计学处理：用spss 12.0统计学软件进行方差分析，实验 数据以x±s表示，p&lt；0. 05认为差异有统计学意义.2结果2. 1 重组质粒 pet28a(+)hsp70egfp 鉴定egfp的pcr产物经10 g/l琼脂糖电泳，在740 bp处可见单 一条带，与预期结果大小一致（图1）重组质粒pet28a（+） hsp70egfp用bamhi, saci和xhol酶切后，经10 g/l琼脂糖电泳，可 见被切下约740 bp, 1990

11、 bp和2730 bp左右的单一条带，分别与 egfp, hsp70和hsp70 egfp的编码基因大小一致（图2）2.2融合蛋白的表达、纯化转化后bl21细菌经0. 1 mmol/l iptg 4°c诱导1218 h,其 全菌蛋白sds page电泳结果见图3.薄层扫描分析结果显示，目 的蛋白表达量在35%以上.镰离子亲和层析表明，用250 mmol/l咪 呢溶液可以洗脱出融合蛋白hsp70 egfp,目标蛋白纯度达到 90.6%,纯化后的融合蛋白hsp70 egfp溶液在室光下呈黄色，经 紫外线灯照射时发出鲜绿的颜色.2. 3外周血来源dcs的培养及鉴定经细胞因子诱导后，于第2,

12、 5和8日采用流式细胞仪检测培 养细胞表型，其结果显示,cdla分别为：0.18, 0.25和0.41； cd80 分别为：0.28, 0.67 和 0. 75； hla dr 分别为：0.26, 0. 73 和 0. 75. 8d时，在倒置显微镜下观察可见胞体增大，形状不规则，突 起明显.2. 4dcs内化蛋白的观察在37£孵育0.5 h后,流式细胞仪检测结果显示，第1, 2和 3组胞内具荧光的dcs分别占总dcs数量的63. 9%, 4. 2%和3. 5%.在 孵育1, 2和24 h后，第1, 2和3组中胞内具荧光的dcs占总dcs 数量的百分率分别为：85. 3%, 83. 2

13、%, 80. 7%； 90. 3%, 91.4%, 88. 8% 和87. 4%, 86. 1%, 89. 2%,组内及各组间平均值的差异无统计学意义 (p&gt；0. 05).2. 5il12酶联免疫斑点实验结果hsp70 egfp刺激物组平均斑点数为134. 09±7. 05/1x105 dcs细胞，明显高于灭活lps刺激物组，平均斑点数为：(33. 78± 1.40/1x105 dcs细胞)和egfp刺激物组，平均斑点数为:(23. 13 ±0. 31/1x105 dcs 细胞)(p&lt；0. 01),与 lps 刺激物组，平均斑 点数为：

14、(146. 36±6.91/1x1o5 dcs细胞)比较，差异无统计学意 义(p&gt；0.05).hsp70与不同抗原的融合蛋白作为肿瘤疫苗，具有明显的抗肿 瘤免疫作用5-8.其原因在于hsp70具有免疫载体分子的作用， 能增强与之结合抗原的抗原性，并发现i1sp70融合蛋白可诱导机体产 生特异性ctl反应的部分主要为其n端约360 aa部分9本研究 将egfp连接于hsp70 c端，获得重组蛋白hsp70 egfp,研究dcs 对hsp70融合蛋白的内化作用.hsp70 egfp的获得，不仅保持了 hsp70诱导细胞免疫活性的功能，还提供了可发出绿色荧光的egfp, 免去

15、再标记hsp70融合蛋白的过程，为示踪dcs对hsp70融合蛋白的 内化作用提供了新手段.有研究发现结构型hsc70和葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein, grp94/gp96)结合 apcs (b 细胞、巨噬细胞和 dcs)通过特异性膜受体被内化10-12 . basu等13的研究发 现，gp96 肽复合物经apc摄取后由mhci分子递呈给免疫系统,这一过程是由受体cd91所介导的.a2巨球蛋白受体又称为低密度 脂蛋白相关蛋白，被确认为gp96和hsc70在鼠apcs的受体.gp96 肽复合物被摄取后的加工过程需要在蛋白酶体和抗原加工相关转 运蛋白的协助下

16、，通过经典的内源性抗原递呈途经与apc表面mhc i分子结合.本研究发现，dcs表面存在hsp70受体，介导了 hsp70 egfp 的内化，并且该受体可被过量hsp70所饱和，受体介导的内化作用同 时被抑制.随孵育时间的延续，三组实验中胞内具荧光的dcs均占总 dcs数量的绝大多数，表明随着时间的推移，除受体介导的内化作用 外，dcs对可溶性蛋白的吞饮作用导致了 hsp70 egfp及egfp的内 化.il 12 eli spot检测结果表明，hsp70 egfp可以诱导dcs 分泌细胞因子il 12,而il 12有强烈的抗病毒和抗肿瘤效应， 被誉为免疫系统行使抗病毒、抗肿瘤的核心调控因子，

17、也被誉为机体 天然免疫系统的关键蛋白质，因而hsp70 egfp具有促进机体的抗 病毒、抗肿瘤免疫效应的作用.至于hsp70 egfp进入胞质后的加 工途径怎样，如何转运并释放egfp,是否增强抗原递呈的效果，还 有待于进一步研究.【参考文献】1 wallin rp, lundqvist a, more sh, et al. heat shock proteins as activators of the irmate immune system j . trends immunol, 2002, 23(3): 130-135.2 koi a, lichtman ah, finberg rw,

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