第七章节微生物的生长

1、1第七章 微生物的生长和遗传变异第一节 微生物的生长及其特性第二节 微生物的遗传第三节 微生物的变异第四节 遗传工程第五节 微生物的驯化与保藏2第一节 微生物的生长及其特性一、生长与繁殖的基本概念二、微生物生长的测定方法三、微生物的生长特性四、微生物膜的生长特性3一、生长与繁殖的基本概念何谓生长？同化作用大于异化作用时，细胞质的量增加，表现在细胞体积或重量的不断增加，这种现象称生长。何谓繁殖？生长一定程度后细胞分裂，这就是细菌的繁殖。个体的生长和繁殖体现为群体的生长。（微生物重量或数目的增加）。 群体生长个体生长个体繁殖群体生长个体生长个体繁殖在微生物学中“只有群体的重复”才更有意义，因此“生

2、长”一般指群体生长。第一节 微生物的生长及其特性4二、微生物生长的测定方法第一节 微生物的生长及其特性生理指标法计数法生物量法定量测定方法直接计数法（显微镜）间接计数法（关注：活细胞染色法、特定细胞计数法）体积法重量法（湿重法、干重法）组分法元素法呼吸强度耗氧量酶活性生物热51. 计数法（1）直接计数法（显微镜）涂片染色法： 一定量样品涂布在载玻片上，染色后计数。滤膜染色法： 一定量样品过滤到滤膜上，然后染色计数。计数之前都需把样品预处理分散分散第一节 微生物的生长及其特性6Measurement of total cell counts全细胞染色法（死活不分）：DAPI染色，染色，DTAF染

3、色染色第一节 微生物的生长及其特性DNADAPI:46-diamidino-2-phenylindole,dihydrochloride2Cl-H2N+NH2CNHH2N -C NH2DAPI染色染色7DNA5-DTAF : 5-(4,6-dichlorotriazinyl) aminofluoresceinOOHOOHOOHNHNNClNClDTAF染色法染色法第一节 微生物的生长及其特性8计数器法: 如血球计数板法比例计数法： 将已知颗粒浓度的液体与待测菌液按一定比例混合后在显微镜下，测各自的数目。（特点：不需测量体积）第一节 微生物的生长及其特性9美蓝染色法（酵母活细胞计数）活细胞：无色

4、死细胞：蓝色口丫啶橙染色法（在紫外显微镜下观察细胞的荧光）活细胞：橙色荧光死细胞：绿色荧光 活细胞染色法第一节 微生物的生长及其特性10Tetrazolium salt reduction methodFormazanNHRNNRNRCH甲撍化合物Tetrazolium chlorideNRRNNNCl-+R四氮唑化合物（染料）四氮唑化合物（染料）染色法第一节 微生物的生长及其特性11TTC：2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride）CNNNN+Cl-无色；被还原后生成红色的2,3,5-三苯基甲撍（TF）：Triphenyl formazanC

5、NNHNN2H+HCl第一节 微生物的生长及其特性常用的四氮唑化合物（染料）12CTC : 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorideCTCCl-NNNNCNCN3+CN3H第一节 微生物的生长及其特性CTCFNHNNNCCNCN3CN3CTCF : CTC-formazane13双重染色法DTAF和CTC双重染色法10m第一节 微生物的生长及其特性14 低活性细胞的计数（细胞增大技术） DVC(Direct Viable Count) methodNNH3CNalidixic acid （萘啶酮酸）(1-ethyl-1,4,dihydro-7-methy

6、l-4-oxo-1,8-aphthyridine-3-carboxylic acid)30C, 18 hour incubatedNalidixic acid Yeast extract第一节 微生物的生长及其特性15（2）间接计数法（活菌计数法）平板计数法：测定菌落数，（注意：可培养的微生物很少） 描述：CFU（colony formation unit） 液体计数法（MPN法，most probable number法）： 最可能数法 主要用于在平板培养基上不易形成菌落的菌 （硝化菌、反硝化菌、硫酸还原菌）液膜法：过滤到滤膜上（把膜放在固体培养基上培养）第一节 微生物的生长及其特性1617

7、（3）特定微生物计数法平板法液体法e.g. Cr6+耐性微生物抗生素抗性菌亚硝酸菌、硝酸菌的计数FISH（荧光杂交法）Fluoreseuce In situ hybridization 16sRNA的碱基组成设计特异的探针（probe） 选择性培养基法第一节 微生物的生长及其特性18Principle of fluorescent in situ hybridization (FISH)rRNAOligonucleotide probeFluorescence第一节 微生物的生长及其特性19FISH法的步骤法的步骤萤光标示探针(Probe)渗透rRNA細胞Hybridization萤光显微镜观

8、察、计数第一节 微生物的生长及其特性2010mFISH法法DTAF染色染色土壤中微生物的测定(例子)微生物微生物同视野第一节 微生物的生长及其特性212. 生物量法（1）测体积：离心或自然沉降后观察体积(粗放的方法)（2）测细胞干重：离心法、过滤法两种 105110C下干燥后称重（干重约为湿重的1020%）活性污泥浓度测定方法：MLSS（mixed liquid suspended solid）混合悬浮固体MLVSS（mixed liquid volatile suspended solid） 550C、2h、马福炉（3）比浊法/光密度法 OD（optical density）450660nm

9、, 可见光第一节 微生物的生长及其特性22（5）细胞含氮量 细菌含氮量12.5%、酵母为7.5% 粗蛋白量6.25N量（6）DNA、蛋白质 同一微生物的DNA和蛋白质含量相对稳定， 所以可以通过测量DNA、蛋白质的量评价生物量。（7）ATP、RNA可以反映活性微生物的量（8）微生物呼吸醌类 1g含活性污泥平均约含1mol呼吸醌类。（4）测细胞含碳量POC（particulate organic carbon）POC12X mg/l特点：快、低浓度也可测TOC（total organic carbon）：总有机碳DOC（dissolved organic carbon）：溶解性有机碳第一节 微生

10、物的生长及其特性23三、微生物的生长特性1、间歇培养（Batch cultivation）和生长曲线（growth curve）接种第一节 微生物的生长及其特性间歇培养：将少量微生物接种于一定量的液体培养基内，在一定条件下培养。培养过程不投加或取出任何东西。这种培养方式叫间歇培养。生长曲线：细胞量随时间的变化曲线称生长曲线。24总细胞数微生物的典型生长曲线活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性2500时间微生物数生长速度缓慢期对数期稳定期衰亡期活菌数总菌数微生物生长曲线（按微生物数目的对数绘制）26时间活微生物重量生长率上升阶段生长率下降阶段内源呼吸阶段微生物生长曲线（按微

11、生物重量绘制）微生物生长曲线（按微生物重量绘制）第一节 微生物的生长及其特性271) 缓慢期(亦称延滞期, lag phase）影响缓慢期长短的因素： 接种龄：种子（inoculum）处于什么生长期。 、 接种量：特别是X0/S0，即初期微生物浓度与基质浓度的比。 培养基成分产生缓慢期的原因：缺乏分解有关基质的酶； 缺乏充足的代谢中间产物 总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数特点：生长速率常数近于零 细胞形态变大 rRNA含量增高 合成代谢较活跃第一节 微生物的生长及其特性282）对数期（stationary phase） 亦称指数期（exponential phase）最短总细胞数活细胞数

12、III培养时间细胞个数细胞数（量）以指数形式增加的时间段。 特点：生长速率最大，世代时间（generation time） 倍加时间（doubling time）酶系活跃、代谢旺盛细胞进行平衡生长，体内各成分最为均匀 第一节 微生物的生长及其特性29指数期的数学描述1dxrkXdt10lnXKtX10KtXXe世代时间0t tGnn 世代数02nXX0lglglg2XXn第一节 微生物的生长及其特性303）稳定期（stationary phase）： 亦称恒定期、最高生长期、生长速率下降期等特点：净增长速度接近零繁殖与死亡速度几乎相等正生长与负生长几乎相等生长速率下降阶段 S很低，其浓度对微生

13、物影响大2dsk Sdt即有机物分解速率与其浓度成正比出现稳定期的原因： 营养物尤其是生长因子耗尽 营养物比例失调代谢物的积累 pH、DO、氧化还原电位的变化第一节 微生物的生长及其特性314）衰亡期（decline phase, death phase）内源呼吸期（endogenous respiration phase）内源呼吸：体内贮藏物质酶等一部分细胞物质的氧化。特点： 细胞形态多型化 细胞会发生自溶现象（autolysis），蛋白质水解酶活力 往往产生芽孢出现衰亡期的原因： 营养物不足（代谢产物的积累） 外界条件恶化总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性3

14、22、间歇培养时微生物生长的数学描述（1）生长与基质浓度的关系微生物比增长速度：1dxdtx单位时间，单位微生物量的增加量max基质浓度s第一节 微生物的生长及其特性33maxssksKs: 饱和常数，与max12的s值相等KsS时maxmaxssSk SkkSmaxsKsMonod公式（莫诺特公式）经验公式（微生物增长）第一节 微生物的生长及其特性34()d xd sad td td sk xd t1d xkxd t1)对数期：b x 项忽略不计(2)细胞浓度变化：()d xd sab xd td ta: 合成系数/菌体收率 污染物转化系数b: 内源呼吸常数总细胞数活细胞数III培养时间细胞

15、个数第一节 微生物的生长及其特性因为S浓度很高S ks352）稳定期（生长下降期 ）：ssk2d sksd tX 变化不大;xconstd xb xd t3）衰亡期（内源呼吸期）：()d sad t项可忽略总细胞数活细胞数III培养时间细胞个数第一节 微生物的生长及其特性36微生物生长期与废水生物处理：（活性污泥等的混合微生物群，也有类似的生长曲线。) 水处理中如何避免缓慢期接种对数期或代谢旺盛的污泥增加接种量污泥驯化（以后详细讲）微生物维持在对数期可获得高的处理能力，即分解速率，但处理效果 不一定好菌活力大，不易凝聚和沉淀需要充足的营养物，故得不到好的水质第一节 微生物的生长及其特性37处于

16、稳定期污泥虽然生长速度有所下降，但有一定的代谢活性，絮凝沉降性能好。 故传统的活性污泥法常运行在这个范围。 衰亡期只出现在某些特殊的水处理场合， 如延时曝气及污泥消化。第一节 微生物的生长及其特性38食料/微生物比代谢速率内源呼吸阶段生长率下降阶段生长率上升阶段（沉降性能好）（沉降性能差）大多数活性污泥处理系统运行范围延时曝气，污泥消化注意：各个阶段的食物/菌量比(F/M)发生变化，相当于活性污泥系统的污泥负荷。第一节 微生物的生长及其特性微生物代谢速率与食料/微生物比的关系393、连续培养（continuous cultivation）是一种连续进料又连续出料的培养方式根据控制因素的不同分为

17、恒浊连续培养（turbidostat）恒化连续培养（chemostat）进料速度保持一定4. 半连续培养（semi-batch cultivation）、半间歇式Fill and draw第一节 微生物的生长及其特性405. 分批补料式培养（fed batch）以低速把高浓度的营养物质连续加入培养器中，但不排出物料。体积是随时间变化的特点：能任意控制培养液中的底物浓度，所以没有流出。供应速度与微生物消费速度达到平衡，所以能保持一定的浓度。主要用于： 有抑制作用的底物 生长因子添加 高浓度菌体培养添加方法定速添加指数添加dvdt=constant第一节 微生物的生长及其特性41四 、 微生物膜的

18、生长特性1. 生物膜的生长液体培养基中加入固体物质(载体)，微生物在其表面吸附、生长、繁殖形成形成膜，这种膜叫微生物膜。第一节 微生物的生长及其特性42从单位固体表面积上的微生物量(mg/cm2)上看可分为6个阶段a. 延滞期b. 加速增长期c. 恒速增长期d. 减速增长期e. 安定期f. 脱落期第一节 微生物的生长及其特性微生物膜的生长模式图43微生物膜的生长过程中密度的变化随着膜厚的增加，密度也发生变化第一节 微生物的生长及其特性44第一节 微生物的生长及其特性微生物膜内部的密度变化45（1）延滞期：细胞吸附在固体表面上的过程（沉降）影响吸附速度的因子：材质、表面性质、形状、细胞的性质、操

19、作条件（2）加速增长期：还没有形成完整的膜（3）恒速增长期： 活性细胞量达到最大，形成完整的膜。膜表面凹凸不平。第一节 微生物的生长及其特性46（4）减速增长期： 恒速增长期与安定期的过渡期，持续时间短。（5）安定期： 增长速度与脱落速度相平衡，膜量及膜厚达到最大值。（6）脱落期： 外因：流体的剪切力 内因：微生物的死亡、气泡的形成，细胞外高分子量的变化。第一节 微生物的生长及其特性472. 生物膜的特性（1）有效膜厚生物膜并不是全部有活性基质的扩散细胞的死亡70200m（平均100 m），并不是越厚越好。第一节 微生物的生长及其特性48生物膜菌群的空间分布的测定 试验方法 荧光原位杂交技术（

20、FISH） 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）用途：荧光信号的定位检测和定量分析。荧光信号的定位检测和定量分析。名称EUB338NONNso190NIT3序列序列5 5- -3 3GCT GCC TCC CGT AGG AGTACT CCT ACG GGA GGC AGCCGA TCC CCT GCT TTT CTC CCCT GTG CTC CAT GCT CCG特异性大部分细菌大部分细菌(Domain bacteria）不和任何细菌杂交氨氧化细菌（氨氧化细菌（-subgroup ammonia oxidizing bacteria）硝化细菌硝化细菌（Nitrobacter spp.）荧光颜色试验所用荧光探针的性质49生物膜内微生物总体的空间分布生物膜生物膜载体载体水相水相z0硝化菌群主要存在于厚度为硝化菌群主要存在于厚度为20203535m m左右的表层左右的表层硝化菌群沿生物膜厚度（硝化菌群沿生物膜厚度（z z方向）的分布情况方向）的