鲍远亮 分子遗传学课程论文

1、成绩 中国农业大学课程论文（2014学年第1学期）课程名称：植物分子遗传学 任课教师： 专 业： 学 号： 姓 名： 鲍远亮 2015年1月28日玉米籽粒胚乳缺陷突变体的基因克隆1 国内外研究现状及发展动态 玉米是世界三大粮食作物之一，在世界经济发展中有着举足轻重的作用。玉米的价值主要体现在玉米的籽粒上，而籽粒中胚乳部分占籽粒重量的73%-85%，所以胚乳的发育程度对玉米籽粒重量及品质起到至关重要的作用，挖掘与玉米胚乳发育相关的功能基因，解析玉米胚乳发育机制是提高玉米产量和品质的基础，具有重大的科技战略意义。玉米学名为zea mays L.，是一年生草本植物，起源于中美洲地区。玉米是目前世界上

2、种植最广泛、产量最高的粮食作物。但在自然条件下，在玉米中会出现突变穗，其突变表型表现为凹陷，没有胚以及胚乳、或者有胚但少胚乳，从而导致玉米籽粒不能发芽并繁殖后代的缺陷型籽粒(defective kernel)。黄荣荣等人利用出现籽粒突变自交系M08649的杂合体与正常自交系齐319构建分离群体对突变体进行遗传分析，共有85个F：代自交穗具有突变籽粒，38个F：代自交穗表现为正常，统计分析发现其符合2：1的分离比例。同时在85个具有突变籽粒的穗子中，共有9 961粒正常籽粒和3 217粒突变籽粒，符合3：1的分离比例，初步证实自交系M08649中控制籽粒发育的突变基因属于单个基因的隐性突变。1突

3、变体是遗传学研究的基本材料，利用自然突变体或者创造人工突变体材料研究基因的生物学功能已经成为功能基因组学的重要研究内容(程红亮等，201 1)，籽粒性状相关的突变在突变体中较为常见。籽粒的胚是生命的原始体，胚乳是积累和贮藏营养物质的场所。所以，籽粒的胚和胚乳的正常发育，对作物的产量和品质都具有重要意义。目前，已经从水稻(Takemoto et a1，2002；Fujita eta1，2009)、玉米(Huang et a1，2010；Phillips and Evans，2011)、油菜、大麦(Olsen et a1，2008)和拟南芥(Yanget a1，2008)等植物中获得了大量籽粒突变

4、材料。在甘蓝型油菜中发现胚柄多胚突变体(刘幼琪等，2006)，在水稻中发现胚乳espl突变体(Ushijima et a1，201 1)以及粉质胚乳突变体(Qiao et a1，2010)，Sato等发现水稻低直链淀粉含量的突变基因眠mq(Sato et a1，2002)。至今报道的玉米籽粒发生突变的基因已有50多个，大部分突变基因主要作用于胚乳细胞(Li et a1，2010；Holding et a12007)或糊粉层细胞(Vi et a1，201 1)，部分基因如ael、sul，su2、WX、du、btl、bt2等影响胚乳中碳水化合物的组成，影响籽粒发育、成熟籽粒表现型、淀粉形态和物理特

5、性以及酶活性，并且在甜玉米(杨泉女和王蕴波，2005；胡建广等，2004)、糯玉米(丁向真等，2008；秦泰辰等，2002)等中已有了广泛的应用。少部分突变基因影响胚特性和胚乳特性，如具有产生不透明胚乳和小胚面的双重遗传效应基因08(宋同明和陆效武。1993)。籽粒突变体在玉米育种及玉米生产中普遍存在，对其进行相关遗传研究，对玉米育种和玉米生产具有重要意义，同时对作物的遗传改良也有重要作用。 玉米的价值主要体现在玉米籽粒上，玉米淀粉85%以上存在籽粒胚乳中，因此胚乳突变体可以不同程度地改变籽粒碳水化合物的数量和质量。已经发现许多表现隐性遗传的单基因胚乳突变体，并把它们定位在玉米细胞遗传学的图谱

6、中。 Holden（1974）和Nelson（1980）分别比较了若干胚乳突变基因型在籽粒发育时期的碳水化合物组份的变化，结果发现某些基因可以显著降低胚乳组织中的淀粉含量，另外一些不导致胚乳淀粉含量下降或降低较少，如wx、su2、du、ae。前者通过减少底物的供应限制淀粉的合成，造成还原糖、蔗糖或水溶性多糖含量提高，被称为淀粉缺陷型胚乳突变基因，因此是甜玉米育种的重要资源。后者可以改变淀粉的化学或物理性质，影响籽粒发育、成熟籽粒表现型、淀粉形态学和物理特性和酶类活性，被称为淀粉修饰型胚乳突变基因，因而是淀粉品质遗传改良的重要种质资源。淀粉修饰型基因可以不同程度地改变胚乳直链淀粉和支链

7、淀粉的比值。wx基因型籽粒含有100%的支链淀粉，而du、su2、ae不同程度地增加直链淀粉含量，其中以ae最为明显，达到50%以上。就支链淀粉含量而言，wx基因对ae、du和su2都表示上位效应，抑制直链淀粉形成。当采用碘化钾法测试比较时，ae的影响比du、su2显著（表面直链淀粉百分率高）。在双基因和三基因隐性突变体中，上位和互补是最常见的基因互作方式。除（ae wx）组合含有少量直链淀粉外，其余包含有wx基因的双基因和三基因组合均不含直链淀粉，ae基因突变体及包含ae基因的双基因和三基因组合都含有较高的直链淀粉。Dunn等人报道了一个玉米三隐性突变体（du su

8、60;su2）中直链淀粉含量达77%，但这个三隐性突变体（du su su2）中的淀粉总含量明显减少。1952年ae1（amylose extender）基因的发现是玉米高直链淀粉育种的重要里程碑，该基因纯合体胚乳中直链淀粉含量显著提高，从野生型25%增加到70%。此后，陆续报道一些ae1基因位点变异体，这些ae位点上的突变基因对直链淀粉含量的影响均没有ae1基因明显，部分仅对直链淀粉与支链淀粉比率起轻微的修饰作用，部分与短链类型直链淀粉合成有关。 研究玉米籽粒缺陷本质，找到玉米籽粒发育缺陷的关键基因是从籽粒上解决玉米玉米发育的重要方向。玉米的重要作用都体现在玉米

9、的籽粒上，而玉米籽粒中淀粉含量直接影响玉米产量。对玉米缺陷胚乳突变体的探索是为了找到它们突变的本质，解释籽粒胚乳中贮藏物质合成、装配、转运的调控机理。籽粒是玉米收获的主要部分，挖掘玉米籽粒发育相关基因，能够揭示籽粒形成以及籽粒灌浆的分子机理，更重要的是为粒重相关候选基因的挖掘、粒重的提高和品质的改良提供了新基因贮备、高水平的材料平台。2 研究内容及研究目标 研究内容：将以经过Mu转座子插入得到的突变体材料与B73背景材料杂交，以获得有胚乳缺陷型的F1材料；然后对F1材料中有突变表型的材料进行了遗传评价和遗传分析；再从之前通过对Mu起始系材料测序而得到的引物库中筛选合适的SSR引物，在每条染色体

10、上分别筛选8对SSR引物，均匀覆盖整条染色体；通过PCR技术初步确定目标基因所在的染色体上的大体位置；接下来便可以精细定位，广撒标记，最终确定目标基因的位置，从而对控制缺陷型胚乳性状的基因进行基因定位和基因克隆。 研究目标：通过构建的实验群体，找出有表型的单株，利用BSA-SSR、染色体步移等方法，将决定该表型的基因精细定位到玉米遗传图谱与物理图谱上，并将它们克隆，再通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。3 拟解决的科学问题 通过图位克隆技术获得控制玉米缺陷胚乳的新基因，克隆该基因并研究其调控机理，从而为玉米籽粒发育进程研究作出贡献。 4 研究方案（1）研究方法1）群体构建。将

11、Mu转座子插入得到的胚乳缺陷型突变体与B73自交系杂交得到F1，F1自交分离性状得到的F2群体。2）BSA-SSR分析。用改良的CTAB法提取F2群体单株DNA，利用群体分离分析法（BSA）随机选10个野生型单株与10个突变型单株的DNA，将其分别混合成两个基因池。利用均匀分布于玉米10条染色体上的SSR引物，用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳技术，对两个亲本进行多态性标记筛选，F1作为对照；将亲本间的多态性标记对两个池进行筛选，并且利用隐性群体定位法来确定控制突变性状的基因在染色体上的大概目标区段；对目标区段内的基因进行生物信息学分析，预测候选基因。3）构建含有大插入片段的基因组文库。4）以与

12、目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库。5）用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群。6）通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆。7）通过亚克隆获得目标的小片段克隆。8）通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的基因序列。（2） 技术路线 5 预期结果及可行性分析 预期结果：获得控制玉米缺陷胚乳性状的新基因。 可行性分析：本实验室具有较好的研究基础，已经利用转座子插入技术获得了许多突变体材料，并且也进行了关于玉米籽粒性状基因的克隆和功能分析，积累了丰富的经验。本研究内容合理，方法可行，课题中涉及到许多分子生物学和生物化学研究的常规试验方法，前人对于这些试验方法的报道已经非常

13、成熟。该研究可以利用本实验室的优良的科研平台以及经验丰富的科研人员，按照既定的实验方案，可以得到预期的实验结果，可行性较强。参考文献：1 Misra PS,Jambunathan R, Mertz ET, Glover DV, et al. Endosperm protein synthesis in maize mutants with increased lysine contentJ. Science, 1972, 176(4042): 1425-1427.2 Schmidt R J, Burr F A, Burr B. Transposon tagging and molecular

14、analysis of the maize regulatory locus opaque-J. Science, 1987, 238(4829): 960-963.3 Coleman C E, Lopes M A, Gillikin J W, et al. A defective signal peptide in the maize high-lysine mutant floury2J. Proc Natl Acad Sci USA, 1995,92(15): 6828-6831.4 Kim C S,Hunter B G, Kraft J, et al. A defective sign

15、al peptide in a 19-kD alpha-zein protein cause the unfolded protein response and an opaque endosperm phenotype in the maize De-B30 mutantJ. Plant Journal, 2004, 134(1): 380-387.5 YOUNG V R, SCRIMSHAW N S, PELLETT P L. Significance of dietary protein source in human nutrition: animal and/or plant pro

16、teins? M. WATERLOW J C, ARMSTRONG D G, FOWDEN L, et al. Feeding a World Population of More Than Eight Billion People: A Challenge to Science . Oxford University Press, 1998: 205-221. 6 Neuffer MG, Sheridan WG. Defective kernel mutants of Maize. I. Genetic and lethality studiesJ. Genetics, 1980,95(4)

17、: 929-944.7 Mertz ET,Bates LS,Nelson OE. Mutant gene that changes protein composition and increases lysine content of maize endospermJ. Science, 1964, 145(3629): 279-280. 8 Coleman C E, Lopes M A, Gillikin J W, et al. A defective signal peptide in the maize high-lysine mutant floury2J. Proc Natl Aca

18、d Sci USA, 1995,92(15): 6828-6831.9 Kim C S,Hunter B G, Kraft J, et al. A defective signal peptide in a 19-kD alpha-zein protein cause the unfolded protein response and an opaque endosperm phenotype in the maize De-B30 mutantJ. Plant Journal, 2004, 134(1): 380-387.10 Nelson OE, Mertz ET, Bates LS. S

19、econd mutant gene affecting the amino acid pattern of maize endosperm proteinsJ. Science, 1965, 150(3702): 1468-1470.11 Kim C S, Gibbon B C, Gillikin J W, et al. The maize Mucronate mutation is a deletion in the 16-kDa gamma-zein gene that induces the unfolded protein responseJ. Plant Journal, 2006,

20、 48(3): 440-451.12 Myers A M, James M G, Lin Q, et al. Maize opaque5 encodes monogalactosyldiacylglycerol synthase and speci fically affects galactolipids necessary for amyloplast and chloroplast functionJ. Plant Cell,2011, 23(6): 2332-2347.13 WU Y, MESSING J. Novel genetic selection system for quan

21、titative trait loci of quality protein maizeJ. Genetics, 2011, 188: 1019-1022.14 Holding D R, Otegui M S, Li B, et al. The maize floury1 gene encodes a novel endoplasmic reticulum protein involved in zein protein body formationJ. Plant Cell, 2007, 19(8): 2569-2583.15 Gibbon B C, Larkins B A. Molecul

22、ar genetic approaches to developing quality protein maizeJ. Trends in Genetics, 2005, 21(4): 227-23316 Wang G, Sun X,Wang G, et al. Opaque7 Encodes an Acyl-Activating Enzyme-Like Protein That Affects Storage Protein Synthesis in Maize EndospermJ. Genetics, 2011. 189(4): 1281-1295.17 Myers A M, James

23、 M G, Lin Q, et al. Maize opaque5 encodes monogalactosyldiacylglycerol synthase and speci fically affects galactolipids necessary for amyloplast and chloroplast functionJ. Plant Cell,2011, 23(6): 2332-2347.18 Damerval C, De Vienne. Quantification of dominance for proteins pleiotropically affected by Opaque-2 in maizeJ. Heredity, 1993, 70: 38-51.19 Wang G, Wang F, Wang G, et al. Opaque1 Encodes