生物化学实验讲义

1、生物化学实验讲义目录1. 实验须知及实验教学要求2. 实验室常用器具3. 实验一 糖的颜色反应4. 实验二 总糖的测定5. 实验四 酪蛋白的制备6. 实验五 酵母核酸的分离7. 实验六 核酸的琼脂糖凝胶电泳8. 实验七 离子交换柱层析法分离氨基酸9. 实验八 维生素C的测定10. 实验九 蛋白质的两性性质和等电点11. 实验十 温度、PH对酶活性的影响12. 常用设备使用说明13.1离心机13.2分光光度计13.3电泳仪器13.4 部分收集器13.5 紫外检测设备13.6 蠕动泵14常用溶液的配置实验须知生物化学实验课是教学的重要环节。通过实验教学，观察某些生化与分子生物学反应现象，联系并加深

2、对理论内容的理解，验证和巩固理论知识；掌握生化与分子生物学实验的基本操作、实验原理和一般仪器的使用；培养科学实验技能和严谨的科学态度，准确记录，科学分析并作出实事求是的实验报告，逐步提高观察问题、分析问题和解决问题的能力，为今后学习生物医学专业后续课程打好必要的基础。为此，要求学生在实验前必须预习、理解基本原理和实验基本操作步骤、注意事项，列出所需试剂和仪器，实验中组织安排好时间，严肃认真地进行操作，细致观察变化，如实作好记录、书写实验报告等。一、实验记录实验记录要整洁、字迹清楚。实验中观察到的现象、结果和数据，要及时地直接记在记录本上。原始记录必须准确、简练、详尽、清楚。记录时，应如实正确地

3、记录实验结果，不可夹杂主观因素。在实验条件下观察到的现象，也应如实仔细地记录下来。在定量实验中测得的数据，如称量物的重量、滴定管的读数、光电比色计的光密度值等，都应设计一定的表格准确记录，并根据仪器的精确度准确记录有效数字。要求对实验的每个结果都应正确无遗漏地做好记录。实验中使用的仪器类型、试剂规格、化学反应式、分子量、浓度等，都应记录清楚。实验过程中，应一丝不苟，努力培养严谨的科学作风。完整的实验记录应包括日期、实验题目、目的、操作、结果。二、实验报告实验结束后，应及时整理和总结实验结果及记录，写出实验报告。实验报告应包括实验名称、实验日期、目的要求、原理、试剂配制、仪器设备、操作方法、实验

4、结果、讨论等项内容。书写实验报告时，目的和要求、原理以及操作方法部分应作简单扼要的叙述，但对实验条件和操作的关键环节必须写清楚。对于实验结果部分，应根据实验的要求，把所得的实验结果和数据进行整理、归纳、分析和对比，并尽量总结成各种图表，如标准曲线图以及实验组与对照组实验结果的比较表等。还应针对实验结果进行必要的说明和分析。讨论部分不是对结果的重述，而是对实验方法、实验结果和异常现象进行探讨和评论，以及对于实验设计的认识、体会和建议。一般实验，要有结论，结论要简单扼要，说明本次实验所获得的结果。三、爱护仪器、节约试剂（一）实验前应检查本次实验仪器是否清洁完整，如有不足可向教师领取；不洁仪器洗净后

5、交教师更换；实验结束应把所有仪器清洗干净；若发生破损，应填写仪器破损记录，注明原因，经教师同意后更换。（二）实验试剂用后立即盖上瓶塞，不得盖错。不无故浪费试药、试剂。（三）贵重或不熟悉之仪器，未经教师许可和指导，不要随意乱动。操作过程中要互相关心、互相帮助。（四）爱护实验动物。四、注意安全（一）用橡胶吸球吸取试液，不要用口吸取试液，不要用口直接以吸管吸取，吸取强酸、强碱或剧毒试剂更需注意。不要肆意摆弄橡胶吸球，以免损坏。（二）勿使易燃试剂（如乙醚、丙酮、苯等）近火，如遇这些物品着火时，要用湿揩布和灭火沙掩盖，不要用水冲。如遇强酸、强碱或有毒试液溅触身体，五、实验室清洁 （一）保持实验室安静、清

6、洁，不准随地吐痰、乱丢纸屑。以讲卫生为光荣，不讲卫生为耻辱。 （二）用过的固体物品（如棉球、滤纸、火柴等）、腐蚀性或有毒物品不得丢在桌上、地下及水槽中，应丢入污物缸统一处理。 （三）每次实验结束，各人负责自己实验桌的卫生整理工作，由值日小组（以实验桌为单位）轮流打扫实验室。实验教学要求 实验要求 1实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、项期的结果，操作关键步骤及注意事项。 2实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实驮过程中出现的现象和结果，结果不良时必须重做。 3实验小，应及时将实验结果如实记录下来学分析，按时将实验报告交教师评阅。仪器保管及清洁 1常用仪器在首次实验时按仪器治

7、单进行清点，换领实验中如有仪器破损必须登记期木如数归还若有缺锁到实验准备室 2实验后，必须把仪器洗净放入炬内、按次序放置好，以提高工作效率并队止破损。 3贵重仪器尤其要尽力爱护，非本次文验使用的仪器未经老师允许不得乱动。本次实验必须使用的仪器，在使用前要了解使用方法，严格遵守操作规程。 4公用仪器，如分光光度计、电动离心机等，每组同学使用时间不宜过长，以免妨碍工作。 5玻璃仪器清洗：一般玻璃仪器都应用洗衣粉或去污粉洗涤、镕酸洗液勿用丁浴场玻璃仪器之洗旅，用过的铬酸洗液须加以保存，直至变为绿色方可弃之，其舍弃法与浓硫酸液相同。蒸馏水使用应遵循少量多次原则。 试剂使用规则 1使用试剂前应仔细辨认标

8、签，看清名称及浓度，是否为本实验所需要。 2取出试剂后，立即将瓶塞盖好，切勿盖错；放回原处；未用完的试剂不得倒问瓶内。 3取标准溶液时、应允将标难液倒入干净试管中，再用清洁吸管吸取标难液，以免污染瓶中的标签溶液。 4使用滴管时，滴管夹端朝下，切勿倒置勿使试剂流入橡皮帽内 5使用有毒试剂及强酸强碱时，尽可能用量筒量取，若用吸管时只能用吸耳球吸取，切勿用嘴吸取，以免造成意外。 安全注意事项 1低沸点有机溶剂，如乙醚、石油醚、洒精等均系易燃物品源，若须加热要用水浴加热，不可直接在火上加热。 2凡属发烟或产生有毒气体的化学实验均应在通风柜内进行，以免对人体造成危害。 3若发生酸碱灼烧事故先用大量自来水

9、冲洗酸灼伤者用饱和NaHCO3溶液中和，碱灼烧者用饱和H3BO3溶液中和，氧化剂伤害者用Na2S2O4处理。 4.若发生起火事件、根据发生起火件质分别采用砂、水、CO2、或CCl4灭火器扑火。 5.离开实验室必须关奸窗户、切断电源水源以确保安全。 废弃物处理 1所以固体废弃物如：用过的滤纸、碎屑沉淀物等必须倾弃丁垃圾简中。2浓酸必须弃于小钵少，用水冲淡，然后倒入水槽中。3实验完成席之沉淀或混合物含有可提取之贵重药品者不可随意舍弃，应交老师保存。实验室清治1实验空必须经常保持消治不得随地吐谈，乱壬纸屑。2实验后要清扫实验台山、地6f。试剂版要码放整齐。3下课时轮流由值日汇打扫卫生经老师检查，方能

10、离开实验室。实验一 糖的颜色反应 一、莫氏(Molisch)试验 原理 糖经浓无机酸(硫酸、盐酸)脱水产生糠醛或糠醛衍生物，它们在浓无机酸作用下，能与“a萘酚生成紫红色缩合物。 试剂 1莫氏试剂：称取“a萘酚5g，溶于95%酒精并用此酒精稀释至100 m1。此试剂需新鲜配制，并贮于棕色瓶中。 21%形蔗糖溶液：称取蔗糖18，溶于100 m1蒸馏水。 31%箱葡萄糖溶液：称取葡萄糖18，溶于l00 ml蒸馏水。 41%好淀粉溶液，将1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水泥和成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅，最后以沸蒸馏水稀释至100m1。 操作 于4文试管中，分别加入lml1葡萄搪溶液，1蔗糖

11、溶液，1形淀粉溶液和少许纤维素(棉花或滤纸浸在1m1水中)然后备加莫氏试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁侵馒加入浓硫酸15m1(切勿震摇！)，硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成2层。观察液面交界处有无紫红色环出现。 二、塞氏(Seliwanoff)试验 一些非糖物质(如糠、糖醛酸等)亦里阳性反应。此外，样液中如含高浓度有机化台物牌团浓曰破的焦化作用，而出现红色，故试样浓度不宜过高。 亦可用麝香草酚或其它苯酚化合物代替a-萘酚。麝香草酚的优点是溶液比较稳定，且灵敏度与萘酚一样。 莫氏试剂应直接滴入试液中，勿使试剂接触试管壁，否则试剂会与硫酸接触生成绿色而掩盖紫色环。 原理 酮糖在浓酸的作用下，脱水生

12、成5经甲基糠蹬，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀镕于乙醇，成鲜红色溶液。 试剂 1塞氏试剂：溶50ml间苯二酚于100ml盐酸中（H2O：HCl=2:1V/V）临用时配制。 21%果糖溶液；称取果糖1g，溶于100ml蒸馏水即成。 31%葡萄糖溶液；见试验一。 41%蔗糖溶液：见试验一。 操作 于3支试管中分别加入1%萄糖溶液，1%蔗糖溶液或1%果糖溶液0.5ml，各加塞氏溶剂2.5ml,摇匀，同时置沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。 三、杜氏(Tollen)实验 原理 戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成深红色物质。 本试验虽常用以鉴

13、定戊糖，但并非戊糖的特有反应。果糖、半乳糖和被醛酸等都呈阳性反应。戊糖反应最快，通常在45秒钟内即产生深红色沉淀。 试剂 1杜氏试剂：2%苯三酚乙醇(95%)溶液3ml,缓缓加入浓盐酸15m1及蒸馏水9ml即得。临用时配制。 21%阿拉伯糖溶液。称取阿拉伯糖1g,溶于100ml蒸馏水即成。 在此实验条件下，蔗糖有可能水解成果糖与葡萄糖，而呈阳性反应。葡萄糖与麦芽糖呈阳性反应，但呈色反应的速度较酮糖缓慢。果糖的红色出现及沉淀的产生，应在加热20-30秒钟内，生成的沉淀必须能溶于乙醇并成红色溶自。 盐酸的浓度不宜超过12%，因在12%盐酸中最易生成核醛或其衍生物。31%半乳糖溶液：溶lg半乳糖于1

14、00ml蒸馏水即成。 41葡萄糖溶液：见试验一。 操作 于3支试管中备加杜氏试剂1m1，再分别加1滴1好葡萄糖溶液，1%半乳糖或l%阿拉伯糖溶液，混匀。将各试管同时放入携水浴中，观察颜色的变化，并记录额色变化的时间。实验二 蒽酮比色定糖法一、目的和要求 1了解多糖水解的基本原理和操作方法。 2掌握蒽酮比色定糖法的原理及方法。二、基本原理 多糖含有几百个或更多残基，但只有一个还原基团，因此它的还原能力极弱，对于它们的测定，应先将它们用酸水解成单糖组分。 蒽酮比色法是一种快速而简便的定糖方法，糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛及其衍生物，该衍生物与蒽酮发生反应，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收。

15、蒽酮也可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同，当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。对于以上特定的糖类物质，反应较稳定。本法多用于测定糖元含量，亦可用于测定葡萄糖含水量。三、材料与试剂1实验材料：多糖。2实验试剂(1)浓盐酸溶液(2)5molL氢氧化钠溶液(3)KI-I2溶液(4)Benebict溶液：溶解85g柠檬酸钠及50g无水碳酸钠于400mL水中，另溶解8.5gGuSO4于50mL热水中，将GuSO4溶液缓缓倾人柠檬酸钠碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀，可过滤。本试剂可长期使用，如放置时间过久，出现沉淀，可取用其上清液。 (5)2gL蒽酮试剂：溶解2g蒽酮1L浓硫

16、酸(AR，d184，98)中，当日配制使用。 (6) 0.1gL葡萄糖溶液(可加几滴甲苯作防腐剂) (7) 0.1gL糖元溶液(可加几滴甲苯作防腐剂)四、实验器材试管及试管架 吸量管(1ml、5mL) 恒温水浴箱(100)制冰机 分光光度计 滴管 白瓷板五、操作方法 1多糖的水解 取约10mI多糖溶液放人试管中，加10滴浓盐酸溶液，慢慢煮沸，每分钟用滴管取出1滴溶液，同已加在白瓷板上的1滴碘液相混合，同时取3滴溶液用NaOH溶液中和，加入含5mlBenebict溶液的试管中，连续取样到6min或者适宜的时候、把这些含有Benebict溶液的各测定管放在100恒温水浴箱中保温3min，冷却后观察

17、并解释结果。 2制作标准曲线 取100mgL的糖元溶液(或100mgL的葡萄糖溶液)0.00、0.20、0.40、0.60、0. 80、1.00mL，分别加入6支试管中，用蒸馏水补足至1.00mL后，再加人300mL蒽酮试剂，迅速浸于冰水中冷却，待几支试管均匀加完后，一起浸入100恒温水浴箱中，为防止水分蒸发，应在试管口上加盖一个玻璃球。自温度重新升至100 起记时，准确保温10min后取出，用流动水冷却。然后，于室温中平衡片刻(约10min左右)，再在分光光度计上，波长620nm，用0. 5cm厚度的比色杯，以空白管做对照空白，进行比色。 3测定样品合糖量 取1 mL无蛋白的糖类溶液，加入3

18、00mL蒽酮试剂，迅速浸于冰水中冷却，冷却后置于100 恒温水浴中，准确保温10min。取出，用流动水冷却后比色。其他条件与测标准曲线相同。 4计算 在标准曲线上查出与测得的未知样品的光吸收值相对应的还原糖质量(mg)，计算出未知样品还原糖浓度(gL)。 思考题 1本法多用于测定什么样品? 2加蒽酮试剂时为什么盛有样品的试管必须浸于冰水中冷却? 3本法是否可以用来测定血液、水果、蜂蜜及蔬菜的总糖含量?是否可以用来测定这些物质的还原糖含量?为什么? 4分光光度计的原理及操作注意事项是什么?实验三 纸层析法分离氨基酸目的与要求 掌握纸层析的基本原理及单向纸层析法分离鉴定氨基酸的基本技术（包括：点样

19、、展层、显色及测定Rf值等)。实验原理 纸层析法是分配层析法的一种，以滤纸为惰性支持物。纸层析所用的展层溶剂大多是由水饱和的有机溶剂组成。滤纸纤维的-OH基为亲水性基因可吸附有机溶剂中的水作为固定相有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移动称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不同故在流动相中的移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。 纸层析法主要是依据混合组分对二相分配系数的差异进行分离，但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。 氨基酸纸层析在滤纸上形成距原点不等的层析点氨基

20、酸在滤纸上的移动速率用Rf表示： 只要条件(如温度、展层溶剂的组分、pH、滤纸的质量等)不变，Rf值是常数，故可做定性分析参考。如溶质中氨基酸组分较多或其中某些组分的Rf值相同或近似，单用一种溶剂展层(单向层析)不易将它们分开。为此，在第一种溶剂展开后。可将滤纸转动90度，以第一次展层所得的层析点为原点，再用另一种溶剂展层即可达到分离目的。试剂 1甘氨酸溶液 50mg甘氨酸溶于5ml水中。 2亮氨酸溶液 25mg亮氨酸溶于5ml水中。 3蛋氨酸溶液 25mg蛋氨酸溶于5ml水中。4氨基酸混合液 甘氨酸50mg、亮氨酸25mg、蛋氰酸25mg共溶于5ml水中。5展层溶剂 正丁醇：乙酸：水=4：1

21、：5(V/V)，摇匀后，放置半天以上。取上层液备用。6显色液 在100ml展层液中加入0.4g的茚三酮即可。器材1新华滤纸。2针、线、尺。3毛细玻管及点样架，4电热鼓风干燥箱或2000W的电炉。5层析缸(高约30cm、直径约15cm，具磨口塞)及层析架。操作步骤 1画原线：在长约20cm、宽约10cm的滤纸条上距短边2.5cm处用铅笔轻轻画一条线。此线称为原线。 2点样：在原线上,从距纸的长边2cm处开始每隔2cm用毛细管依次分别点上甘氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和混合氨基酸溶液。每一点的直径应不超过2mm。 3层析：将点样后晾干的滤纸挂入预先放入展层溶剂的密闭的层析缸中进行层析，滤纸的上端固定，有原

22、线的下端浸入溶剂中，但原线必须保持在液面之上，以免氨基酸与溶剂直接接触。 4显色：在展层溶剂中加茚三酮显色剂。经层析2-3小时后取出滤纸，直接在80左右烘35分钟，即出现紫红色的氨基酸斑点。 5分别求出各氨基酸的Rf值。注意事项 1样品中含有盐分或其它杂质，以及点样过多，均会影响样品的有效分离。 2显色反应受温度、pH、时间等因素的影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐破会使氨基酸不易显色，或显色点上出现白斑。此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。实验四 酪蛋白的制备实验目的学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。实验原理牛乳中主要的蛋白质是酪

23、蛋白，含量约为35gL。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为47。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至47时，酷蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酷蛋白。实验材料一 试剂1牛乳。295乙酵。3无水乙醚。402mol/L pH 47的醋酸醋酸钠缓冲液。5乙醇乙醚混合液：乙醇：乙醚1：1(VV)二 器材1离心机。2抽滤装置。3精密pH试纸或酸度计4.电炉。5烧杯(500ml)。6温度计。实验方法1.将100ml牛乳放到500ml烧杯中，加热到40，在搅拌下慢慢地加入预热到40、pH47的醋酸醋酸钠缓冲液100ml。用精密的pH试纸或强度计调pH至4.7。将上

24、述悬乳液冷至室温，离心(3000rpm)，10min，弃去清液，得酷蛋白粗制品。 2用水洗沉淀3次，离心(3000rpm)10min,弃去上清液.3在沉淀中加入30ml乙醇，搅拌片刻，将全部悬乳液转移至布氏漏斗中抽滤，用乙醇乙醚混合液洗沉淀2次，最后甩乙醚洗沉淀2次，抽干。 4将沉淀取出，摊开在表面皿上以除去乙醚，干燥后得酷蛋白纯品。结果处理 准确称重，计算出每100ml牛乳所制备的酷蛋白量(g)，并与理论含量(3. 5g)相比较，求出实际的得率实验五 酵母RNA的提取 原理 酵母核酸中RNA含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA

25、制品。 材料及试剂 (一)干酵母粉(市售)。 (二)0.2%氢氧化钠溶液；2g Na0H溶于蒸馏水并稀释至1000mL。(三)乙酸。(四)95%乙醇。(五)无水乙醚。(六)10硫酸溶液：浓硫酸(比重184)10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml。(七)氨水。(八)5%硝酸银溶液：5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100m1，贮于棕色瓶中。(九)苔黑酚三氯化铁试剂；见实验三十三。操作(一) RNA的提取：贸4g干酵母粉于100m1烧杯中，加入0.2NaoH溶液40 ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。加入乙酸数滴，使提取液呈酸性(石蕊试纸)，离心1015分钟(4000rPm)。取上清液，加入95

26、%乙醇30 m1，边加边搅。加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95乙醇洗2次(每次约10ml)，继续用无水乙醚洗2次(每次10ml)，洗涤时可用细玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可作鉴定。 (二)鉴定：取上述RNA约0.5g，加10%硫酸液5ml，加热至沸1-2分钟，将RNA水解。 1取水解液0.5m1加苔黑酚FeCl3试剂1m1，加热至沸1分钟观察颜色变化。 2水解液2m1，加氨水2ml及5%硝酸银溶液lml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物。 3磷的测定(见实验三十二)。实验六 DNA的琼脂糖凝胶电泳 凝胶电泳是研究该酸、蛋白质等生物大分子的一项重要技术，也是DNA的限制性

27、内切酶切割片段的分析、分离、纯化的一种不可缺少的方法。以琼脂糖(agarosc)凝胶为支持介质的电泳已广泛应用于核酸研究中，琼脂糖凝胶电泳技术为DNA分子及其片段的Mr测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。 图 5-5 各种不同Mr及不同的DNA电泳图谱（示意图）DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同(参看实验二十一原理部分)。DNA分子在高于其等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构象有关。由于DNA分子或DNA片段的Mr差别，电泳后呈现迁移位置的差异(见图55，5)。当起螺旋的DNA转

28、变成同一Mr，的开环或线状DNA时，电泳后迁移位置明显不同(见图55.1.2.3.4.5.6、7、8)。琼脂糖凝胶电泳所需DNA样品量仅05一1ug。若用很薄的平板型琼脂糖凝胶进行电泳，则样品DNA量可低于05ug。琼脂糖凝胶对DNA的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA(参见表51)。琼脂糖凝胶电泳通常采用电流方向恒定的条件下进行DNA的分离。长度达10 000kb的更大的DNA可以通过电流方向呈周期比变化的脉冲电泳进行分离(见实验五十三)。而分离小片段DNA(5500bp)则需采用聚丙烯酰肤凝胶电泳，其分辨力极高，能分离相差1bp的DNA片段。表5

29、1 不同浓度琼脂檀凝胶分离DNA的范图 琼脂糖凝胶的制备与聚丙烯酰胺凝胶相比，操作简便、快速，制成的凝胶具有一定的硬度，支撑性能较强，因此，通常在进行DNA样品分析及A4r测定时多采用琼脂糖凝胶。在测定小的DNA分子或片段的链长时才使用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶可用于垂直管型电泳，也可用于平板型电泳。而用平板型电泳这一技术只有更多的优点，因为可将多个样品与标准样品在同一块凝胶板上进行电泳，因此，各样品的出泳条件是完全一致的，便于对多种实验样品进行比较。溴乙暖染色原理及其灵敏度：溴乙唉(ethtdium bromNe，简称EB)分子结构式如下； 观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料E

30、B染色。EB是一种扁平分于，它可以嵌入核酸双锭的配对碱基之间在紫外线激发下，发出红色荧光。激发荧光的能量来源丁两个方面，一是核酸吸收254nm的紫外线后将能量传给EB，二是结合在DNA分子中的EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外线的能量。来源于这两个方面的能量，最终激发EB发射出波长为590nm的可见光谱红橙区的红色荧光。EBDNA复合物中的EB发出的荧光比游离的凝胶中的EB本身发射的荧光强度大10倍，因此不需要洗净凝胶中游离的EB也可以检测出DNA的条带。若核酸量很少，而EB造成背景太深致使带型不清时，则需进行背景的脱色，它可检出10ng或更少的DNA含量。 ED可用于单锭(DNA

31、或RNA)或双链核酸的检测,但染色体对单链核酸的亲和力相对较小,荧光产率也相对较低。操作方法：一、琼脂糟胶液的制备称取07g(或1g)琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100mLpH83Tris硼酸-EDTA缓冲液89 mmolLTris，89m molL硼鼓，25m molL EDTAl，瓶口扣一个小烧杯，置于家庭用小型高压锅内,加热冒出大量蒸汽时扣阀，维持810分钟，琼脂糖即可全部熔化于缓冲液小取出摇匀。即成为07(或1)琼脂糖胶液。可立即使用。如换用微波炉融化琼脂糖则更加方便。需在熔化过程中，戴隔热手套，将瓶取出轻轻摇动，使沾附在瓶壁上的琼脂糖进入溶液。注意：琼脂糖溶液在微波炉内加热时间过长，溶

32、液将过热并暴沸。加热前应在瓶壁上做好液面高度的标记，必要时用水补充蒸发丢失的水分。有几种不同的缓冲液可用于天然双链DNA的电泳。这些缓冲液含EDTA(pH80)相Trih乙酸(TAE)、Tris硼鼓(TBE)或Tris-磷酸(TPE)。常用的电泳缓冲液的配制参见附录十九(四)TAE的缓冲容量相当低，长时间电泳会使其缓冲容量丧失(阳极呈碱化，阴极呈酸性)。TPE和TBE比TAE成本稍高，但它们的缓冲容量较高。双链线状DNA片段在TAE中的迁移速度比在TBE或TPE中快将近10，但这些系统的分辨能力几乎相同，只是超螺旋DNA在TAE中的分辨率比在TBE中更好。最常用的变性单链DNA的电讯缓冲液是出

33、50mmmolLNaOH和1mmolL EDTA组成的碱性电泳缓冲液见附录十九(四)2。在氢氧化钠溶液中，琼脂糖个能熔化，因此，在加氢氯化钠EDTA浓贮存液前、应先在水中熔化琼脂糖。二、凝胶挂的制备如采用垂直柱型电泳，则需制各凝胶柱。取数支10cm×0.6cm的玻璃管，其一端用一小段乳胶管套住，并塞以玻璃珠，使玻璃管底部密封，并在管底部放12墒50甘油。向管中加入熔化的琼脂糖胶液直至管口，待胶洒凝固后，将管的顶端用尼龙纱网套体倒转放置，此时尼龙纱网过于下端，使凝胶不致滑出。去掉灌胶前套上的乳胶管，将凝胶杜横放使凝胶滑出管口少许用刀片修平，使凝胶长度恰为9cm。然后将胶条滑回管中。将凝

34、胶管安装到电认槽上，灌入上、下槽电极缓冲液，备用。三.凝胶板的制备 平板型凝胶电泳可分为垂直板型和水平板型两种。 水平板型电泳槽是目前进行琼脂糖凝胶电泳使用员普遍的装置。水平板型凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或两侧带有挡板的胶模上灌制。如用玻璃板，则灌胶前需用胶带纸或医用胶带将四周贴成个围墙，以防胶液渗漏。如使用与电泳槽配套购置的削胶模，则只得在灌胶前封住两端。 将熔化的胶液冷却至约60时，灌注于胶膜上以后，立既将梳子插在胶膜的一端，注意梳齿两侧不能带入气泡。如在玻璃板上制胶，则用两个书夹侧立于台面上，夹住梳子两端、使梳子固定，并垂直立丁凝胶液中，但梳齿必需与胶模底部保持约12mm的

35、距离，室温放置1520分钟后，凝胶液冷却形成凝胶块。使用前轻轻拔下梳子，即可见到加样品用的孔格、孔格的底部都应有1-2mm的凝胶，保持样品不会泄漏。电泳前切记撕去胶带，使凝胶与正、负电极槽相通。垂直板型电泳的港胶方法如下：向预先装置好的垂直板型电泳槽的凝胶模底部加适量琼脂糖凝胶，待其冷却后，即可将胶模底部的缝隙堵住。待其余的琼脂糖胶液温度降至60时，立即灌入凝胶模中。迅速将样品槽模板插入胶液顶部。在室温放置051小时，待胶液全部凝结后，轻轻拨出样品槽模板，则在胶的顶部形成相互隔开的样品槽。为防止琼脂搪凝胶中水分蒸发而造成裂缝，应将电极槽内灌好电极缓冲液，井同时检查有无渗漏之处。四、加样 线肢体

36、DNA经某种内切酶水解后，得到分于量不同的大小片段。为检测酶切后形成几个片段以及各片段的Mr范围，可将此样品溶液混入溴酚蓝.甘油溶液(样品溶液：染料溶液4：1VV)进行电泳。各种加祥用的含有染料的缓冲液，参见附录十九(四)3同时另取个DNAEcoRI酶水解液做为已知分子量的标准，在同一凝胶板上进行电泳。为得到清晰的电泳图谱，一般DNA样品量最好在05-lug之间。用微量注射器将待分离的样品注入凝胶柱顶部或平板胶的样品槽中。混合在样品中的甘油可增加样品液的比重，因此品可以自然平铺干样品槽中，并且不易扩散，由于溴酚蓝染料的存在,可直接观察到加样的情况，而且染料在电泳过程中可作为指示标志。五、电泳

37、(1)07琼脂糖凝胶校(9cm×06cm)，pH83，Tris硼酸EDTA缓冲液，通电维持电压降11Vcm，22mA管，约15小时。 (2)1琼脂糖凝胶板(130m×110mm×2mm)，pH83，Tris硼酸EDTA缓冲液，通电维持30V，7mA，约需34小时。观察染料距凝胶底部12cm时断电。六、染色及观察电泳完毕，将电源管底部的尼龙网取下，凝胶柱即可滑出，如为板型电泳，则取出凝胶模,揭去其中一例的玻璃板，将凝胶推到一块干净的玻璃板上，浸于0.5EugmL溴乙啶溶液中浸半小时后取出。干254nm或300nm波长紫外灯下进行观察，DNA存在的位肯呈现橙黄色的荧光

38、，放置时间超过4-6小时后荧光减弱。因此，初步观察后，应立即照像。采用国产全色胶卷，拍照时加红色滤色镜。根据照片，可将样品DNA片段迁移位置与DNA EcoRI酶水解片段相对照，初步估计样品中各DNA片段的Mr范围。不同波长紫外线在相同条件下照射EBDNA复合物对染色的灵敏度以及DNA产生断裂缺口等影响不同。注意：溴乙啶是较强的致突变剂，配制和使用溴乙啶溶液时要戴一次性手套或橡皮手套，勿将溶液滴洒在台面或地面上。对于含有溴乙锭的溶液也不应该直接倒入下水道，应进行净化处理，淬灭溴乙锭的致突变能力参见附录十九(九)。待操作熟练后，可将胶液中预先加入溴乙啶，使其浓度达到05ugmL，电泳完毕，取出，

39、可立即在紫外灯下观察。试剂：1.pH83Tris硼酸EDTA缓冲液89mmolL。Tn s，89mmolL硼酸，2. 5mmolL置EDTA：称取10780gTris，5500g硼酸，0930g EDTANa2溶于无离子水，定容到1000mL。 2琼脂糖 3溴酚蓝甘油溶液(005溴酚蓝-50甘油溶液)：先配制01溴酚蓝水溶液,然后取1份01溴酚蓝溶液与等体积的甘油混合即成。 4已知分子量的标准DNA：DNA的EcoRI水解液(水解方法见实验五十八)，含有6个Mr不同的DNA片段，其Mr，顺序为137×l06、474×l06、373×l06、348×l06

40、、302×l06、213×l06。其电泳图谱，见图55。 505ugmL溴乙啶染色液：称取5mg溴乙啶,用无离子水溶解,定容到10 mL,取1 mL稀释到1000 mL,最终浓度为0.5ug/mL释到1000mL最终浓度为o5P8mL。器材： 1垂直柱型电沉槽或垂直板型电泳槽装置 2. 家庭用小型高压锅 3. 254nm或302Mm波长紫外分析仪 4照侣设备 5 全色胶卷(国产)6直流稳压电源(0.600V-0.50mA)7微量取液器(100uL或20uL)8一次性塑料手套9红色滤色镜l0DNA样品：新制备的线粒体DNA或质粒DNA等。实验七 离子交换柱层析法分离氨基酸一、

41、目的要求1了解离子交换树脂层析法的工作原理及操作技术。2学会用离子交换构脂层析法分离混合氨基酸。二、实验原理 离子交换树脂是一种合成的高聚物，不溶于水，能吸水膨胀。高聚物分子由能电离的极性基因及非极性的树脂组成。极性基因上的离子能与溶液中的离子起交换作用，而非极性的树脂本身物性不变。通常离子交换树脂按所带的基团分为强酸(RSO3H)、弱酸(COOH)、强碱(一N+R3)和弱碱(NH2，NHR，NR2)。 离子交换树脂分离小分子物质如氨基殃、腺苷、腺苷酸等是比较理想的。但对生物大分子物质如蛋白质是不适当的，因为它们不能扩散到树脂的链状结构中。故如分离生物大分子，可选用以多糖聚合物如纤维素、葡聚塘

42、为载体的离子交换剂。本实验用磺酸阳离子交换树脂分离酸性氨基酸(天冬氨酸)、中性氨基酸(丙氨酸)和碱住氨基酸(赖氨酸)的混合液。在特定的pH条件下，它们解离程度不同，通过改变洗脱液的pH或离子强度可分别洗脱分离。三、实验材料 1磺酸阳离子交换树脂（Dowex 50）。 22molL HCl。 32molL NaOH。 4pH 42的柠檬酸缓冲液：0.1mol/L柠檬酸54ml加0.1mol/L柠檬酸钠46ml。 01m。I儿柠檬酸钠46mI 501molL HCl。 601mol/L NaOH 7pH 5的醋酸缓冲液：0.2mol/L NaAc 70ml加0.2mol/L HAc 30ml。 8

43、02中性茚三酮溶液：02g茚三酮加100ml丙酮。 9氨基酸混合液：丙氨酸、天冬氨酸、赖氨酸各10ml加0.1mol/L HCl 3ml。四、实验步骤 1树指的处理：100m1烧杯中置约10g树脂，加25ml12mol/L HCl搅拌2h，倾弃酸液，用蒸馏水充分洗涤树脂至中性。加25ml 12mol/L NaOH至上述树脂中搅拌2h，倾弃碱液，用蒸馏水洗涤至中性将树脂悬浮于50ml pH42柠檬酸缓冲液中备用。 2装柱：取直径0812cm、长度为1012cm的层析柱，底部垫玻璃棉或海棉圆垫，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，等树指沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积

44、至8-10cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH 42柠檬酸缓冲液洗涤人，使流出液pH为42为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。 3加样、洗脱及洗脱液收集：打开出口使缓冲液流出，等液面几乎平齐树脂表面时关闭出口(不可使树脂表面干掉)。用长滴管将15滴氨基酸混合液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内。当液面刚平树脂表面时，加入01mol/L HCl 3ml，以10-12滴/min的流速洗脱，收集洗脱液，每管20滴，逐管收存。当HCl液面刚平树脂表面时，用1ml pH 42柠檬酸缓冲液冲洗柱壁一次，接着用2ml pH 42拧檬酸缓冲液洗脱，保持流速10-12滴/min并注意

45、勿使树脂表面干燥。 在收集洗脱液的过程中，逐管用茚三酮检验氨基酸的洗脱情况，方法是：于各管洗脱液中加10滴pH 5醋酸缓冲液和10滴中性茚三酮溶液，沸水浴中煮10min，如溶液显紫蓝色，表示已有氨基酸洗脱下来。显色的深度可圾代表洗脱的氨基酸浓度，可比色测定。在用PH 42柠檬酸缓冲液把第二个氨基建洗脱出来之后，再收集两管茚三酮反应阴性部分，关闭层析拄出口，将树脂顶部的剩余pH 42柠檬酸缓冲液移去。于树脂顶部加入2ml 01mol/NaOH，打开出口使其缓慢流入柱内，按上面操作继续用01mol/L NaOH 洗脱并逐管收集(注意仍然保持流速10-12滴/min)，每管20滴。做洗脱液中氨基酸检

46、验，在第三个氨基酸用01mol/L NaOH洗脱下来以后，再继续收集两管茚三酮反应阴性的部分。最后以洗脱液各管光密度(以水作空白，在570nm波长读取光密度)或颜色深浅(以、±、+、+表示)为纵坐标，洗脱液管号为横坐标作图，即可画出一条洗脱曲线。五、注意事项 1在装拄时必须防止气泡、分层及柱子波面在树脂表面以下等现象发生。2一直保持流速10-12滴/min，并注意勿使树脂表面干燥。实验八 维生素C的测定实验九 蛋白质的两性反应和等电点的测定一、目的和要求1.了解蛋白质的两性解离性质。2.学习测定蛋白质等电点的一种方法。二、基本原理蛋白质分子是由氨基酸组成的，而氨基酸带有对解离的氨基(

47、NH3+)和羧基(一COO-)，是典型的两性电解质。蛋白质分子虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基、胍基、咪唑基等酸碱基因。因此、蛋白质和氨基酸一样是两性电解质在一定的PH条件下就会解离而带电。带电的性质和多少取决于蛋白质分子的性质、溶液的PH值和离子强度。在蛋白质溶液中存在下列平衡： 蛋内质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当调节溶液的PH达到一定的数值时蛋白质分子所带正、负电荷的数目相等、以兼性离子状态存在在电场中，该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点(P1)。当溶液的pH值低于蛋白质的等电点时，

48、蛋白质分子带正电荷，为阳离子；当溶液的pH值高于蛋白质的等电点时蛋白质分子带负电荷，为阴离子。在等电点，蛋白质的物理性质如导电性、溶解度、黏度、渗透压等都降为最低，可利用这些性质的变化测定各种蛋白质的等电点最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验采用蛋白质在不同pH值溶液中形成的溶解度变化和指示剂显色变化观察其两性解离现象，并从所形成的蛋白质溶液混浊度来确定其等电点，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。不同蛋白质各有其特异的等电点，其中偏酸性的较多，如牛乳蛋白的等电点是4.74.8，血红蛋白质的等电点为6.76.8，胰岛素的等电点是5.35.4，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋

49、白其等电点在12.012.4之间。三、材料与试剂1实验材料：酪蛋白2实验试剂 (1)0.5酪蛋白溶液(以0.01 mol/L Na()H溶液作溶剂) (2)酪蛋白乙醇钠溶液：称取酪蛋白3g，放在烧杯中，加入1.0mol/L NaOH溶液10mL,微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白质溶液转移到500mL容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒人容量瓶中，再加人1.0mol/L乙酸50mL，摇匀，用蒸馏水定容至500mL。塞紧瓶塞，混匀，溶液略呈混浊，此即为溶解于0.1mol/L。乙酸钠溶液中的酪蛋白胶体。(3)0.01溴甲酚绿指尔剂(变色pH范围：3.6-5.2）(4)0.02molL HCl溶液(5)0.02mnL NaOH溶液(6)1.0molL NaOH溶液(7)0.01molL乙酸溶液(8)0.1molL乙酸溶液(9)1.0molL乙酸溶液四、实验器材试管及试管架 滴管 吸量管五、操作方法1蛋白质的两性反应(1)取1支试管，加0.5酪蛋白溶液20滴和0.0