透射电镜样品制备方法

1、透射电镜样品制备方法由于电子束穿透能力限制， 必须把标本切成厚度小于 0.1um 以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是 50-70nm。在透射电镜的样品制备方法中， 超薄切片技术是最基本、 最常用 的制备技术。 超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似， 需要经过 取材、固定、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。 一 取材的基本要求组织从生物活体取下后，如果不立即进行适当处理，会由于 细胞内部的各种酶作用，出现细胞自溶现象。此外还可能由于污 染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏，因此，为 了细胞结构尽可能保持天然状态，必须做到快、小、准、冷。(1) 动作迅速

2、，组织从活体取下后应在最短的时间内(争取1分钟内)投入 2.5%戊二醛固定液。(2)所取组织的体积要小，一般不超过 1mm*1mm*1mr也可将组 织修成1mm*1mm*2mr小长条形。因为固定剂的渗透能力较 弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。( 3) 机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫 伤与挤压。(4)操作最好在低温(OC4C)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。（5）取材部位要准确取材方法将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用 新的、锋利的刀片将组织切下并修小，然后用牙签或者镊子将组 织块移至盛有冷的固定液的1.5ml离心管中。如果组织块带

3、有较 多的血液和组织液，应先用 PBS洗几遍，然后切成小块固定。1. 动物及人体组织的取材（在冰浴上进行）动物组织的取材，应麻醉（1%戊巴比铵5ml/kg体重腹腔 注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一 小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、 无油污的锋利双面刀片将材料切成大约 1mn宽，23mn长的小 块并从中选出受损伤较小的小条，再将其切成1mm勺小块，最 后用牙签将这些小块逐一放入盛有预冷的、新鲜固定液的1.5ml管内，放入冰箱冷藏室低温固定（04C） 2-4小时或以 上。*固定结束后，将固定液用_PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存。送样前请

4、用_PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室。2. 体外培养细胞的取材（在冰浴上进行）培养在培养瓶中的细胞取材时，先倒出部分培养液，然后 用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，将细胞悬液转移到离心管中， 离心机4C低速离心（2000转/分）10分钟，使细胞聚成团块，弃去上清，沿壁小心加入新鲜的固定液，保持细胞成团状态，于4C冰箱中固定2小时以上。*固定结束后，将固定液用_PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存。送样前请用_PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室。对于血液及其他细胞悬浮液，不宜直接固定，可在取材后将其放入离心管，以2000-4000转/分的速度离心10-15分钟， 待样品在离心管

5、底部集结成团块状后，用吸管吸出上清液，再 缓缓滴入固定液稍加固定，然后用刮铲将样品取出并切割成小 块，再行固定。3. 植物组织取材植物组织的取材比较容易，它的细胞离体后变化不像动物 细胞那么迅速，但植物细胞的细胞壁阻碍着固定液的迅速渗 透，因此，植物材料的取材宜切成薄片状或牙签状，经适当的 固定后再切成小方块。*固定结束后，将固定液用_PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存。送样前请用_PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室。4. 细菌及藻类等样品取材对于不易成团的样品，需先清洗，加入固定液后吹散，于4C冰箱中固定2小时，固定结束后，PBS清洗3次，继续按 照文献琼脂铸模法制备透射电

6、镜样品（白焕红）内描述方 法进行琼脂预固定。再将琼脂预包埋后的样品于 4 C冰箱中固 定过夜。*固定结束后，将固定液用PBS稀释三倍，样品于该溶液 中在4C冰箱保存。送样前请用_PBS浸泡清洗3次，贴好标签 送至电镜室。缓冲液配方磷酸盐缓冲液(三个步骤)1. 磷酸盐缓冲液(0.2M)甲液：0.2M的磷酸氢二钠溶液乙液：0.2M的磷酸二氢钠溶液Na2HP(42HzO35.61gNaHPOHbO 27.60g(Na2HPO7fO)53.65g(NaH2PQ2H2O) 31.21g(Na2HPO12H2O)71.64g加蒸馏水溶解成1000ml加蒸馏水溶解成1000ml2. 按下表混合甲、乙两液既得所需 pH的0.2M缓冲液0.2M磷酸盐缓冲液的配制pH6.46.66.87.07.27.47.67.88.0甲液(ml)26.537.549.061.072.081.087.091.594.7乙液(ml)73.562.551.039.028.0