肌苷育种MicrosoftWord文档

1、天津科技大学硕士学位论史摘要本文以代谢控制发酵理论为指导，重点研究了肌苷高产菌的选育及其发酵条件。主要研究内容和结果如下：1建立了发酵液中肌苷定量测定的方法离子交换法，对其最佳分离条件进行了研究，并与纸层析法进行比较，发现该方法准确度和精确度比纸层析方法高，可用于简单条件下对肌苷发酵液中目的产物的测定。2以枯草芽孢杆菌TY一21为出发菌株，通过硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育出一株肌苷产生菌TX一3，其遗传标记为腺嘌呤缺陷、硫胺素缺陷、8氮鸟嘌呤抗性和磺胺胍抗性(Ade。+TH+8AG。+SG。)。在未经优化的摇瓶发酵条件下可产肌苷1241dL。3研究了枯草芽孢杆菌(Bacillus subt

2、ilis)TX一3摇瓶发酵生产肌苷的最佳条件。通过均匀设计和模式识别方法分别研究了肌苷种子和发酵培养基的最佳配比。在最佳条件下，摇瓶分批发酵产量为1894L。同时采用流加方式研究了摇瓶补料分批发酵条件，该条件下肌苷产量可达到2479L。4利用5 L罐分批发酵数据，对发酵过程进行了代谢流分析。基于物流平衡原理，初步进行了发酵过程的代谢流分析；结合发酵过程曲线分析了肌苷发酵全程代谢行为；应用TX一3菌株的代谢流量平衡模型计算出了肌苷发酵中后期的代谢流分布并通过MATLAB软件线性规划得到理想代谢流分布，结果表明尽量降低EMP途径的代谢通量有利于肌苷的合成，提高肌苷合成途径中各关键酶的活力可有效增加

3、肌昔的生成量，减少副产物的生成和提高发酵过程溶氧水平均可增加肌苷合成代谢流。关键词：肌苷，枯草芽孢杆菌，诱变育种，发酵，代谢流分析天津科技大学硕士学位论文AbstractAccording to the theory of metabolic control fermentation，the dissertationfocuses on the breeding and fermentation condition of inosine producing strainThe main research contents and results are as follows：(1)The me

4、thod of ion exchange chromatography was defined to determinateinosine concentration quantitatively in the fermentation brothThe separationconditions of this method was optimized and compared with paperchromatography methodBoth accuracy and precision are better than that of paperchromatography(2)One

5、inosine highproducing strain TX一3(Ade一+Thi+8一AG+SG)wasderived from Bacillus subtilis TY-21 with DES treatment，which could produceinosine 1241 gL under the fermentation condition without being optimized(3)The batch fermentation condition of strain TX一3 in shake flask was studiedin this dissertationTh

6、e proportions of seed medium and fermentation mediumwere optimized by pattern recognition and uniform design experimentThe seedculture conditions and fermentation conditions were also studiedUnder theoptimum condition，strain TX-3 could produce inosine 18949L by shaking flaskbatch fermentationMeanwhi

7、le the fed batch fermentation conditions were studiedThe production of inosine under optimized fed batch fermentation was 24799L(4)The metabolic flux analysis was applied in inosine fermentation processbased on the experimental data from batch fermentation in 5-liter fermentorBasedon the flux balanc

8、e principle，the metabolic flux analysis method of inosine batchfermentation was definedThe whole metabolic process of inosine was analysedcombined with fermentation process curveUsing metabolic flux balance model ofinosine synthesis by Bacillus subtilis model，the metabolic flux distributionsduring t

9、he middle and last period were determination and the optimal fluxdistributions were calculated by linear program of MATLAB softwareThe fluxanalysis indicated that reducing the metabolic flux of EMP pathway were useful tOlie synthesis；Increasing activities of key enzymes in inosine biosynthesis pathw

10、aywould increase inosine productionReducing byproduct synthesis were importantfor inosine high producing，as well as the heightening soluble oxygen levelKeywords：Inosine，Bacillus subtili，mutagenic breeding，fermentationmetablic flux analysis天津科技大学硕士学位论文1前言11肌苷的理他性质肌苷(1nosine，缩写IR)又称次黄嘌呤核苷，是次黄嘌呤和核糖的缩合物

11、，其磷酸酯为肌苷酸。次黄嘌呤核苷中，在次黄嘌呤碱基N-9的位置上，以糖苷键的形式联结了以呋喃形式存在的核糖的第一位碳原子。肌苷分子式为C1。H12N405，相对分子质量26823，其化学结构为：oH肌苷为白色结晶或呈无水粉末状，易溶于水，口H近中性。在饱11水溶液中约含肌苷15盛，L。在稀盐酸或氢荤眦钠溶液中易溶，在氯仿、乙醇中不溶。无臭，昧微苦。熔点为218。C“。肌营在水中存在三种晶体形式：(1) 两个结晶水的晶体(常见的肌苷)(2)a型(斜方晶)无水晶体(3)a型(单斜晶)无水晶体 常温下(<加)，肌昔主要以两个结晶水的晶体形式存在；在较高温度下，存在两种无水晶体形式。肌苷分子中的

12、碱基存在酮式和烯醇式互变异构现象，所以在碱性条件下烯醇式结构的分子能显示出弱酸|生，和碱反应生成盐。肌苷钠容易和水结合成带25个结晶水的月n苷钠晶体，在水中溶解度增大。在肌苷工业生产中，利用肌苷和Hn昔钠盐之溶解度不同的性质，通过调整溶液pH值的方法，将肌苷从溶液中结晶分离出来。胍苷除了能和碱反应生成盐外，还可和酸反应生成盐，这是由于目n苷分子中碱基上的氰原子和氢离子作用的结果。在朋着工业中，将肌苷发酵液的DH值调为34，使肌苷变成带正电荷的离子，然后将该渤盈过阳离子交换树脂，使肌苷阳离子在树脂上进行交换并吸附，其它不带正电荷的杂质则不被交换吸附，使月n蔚得到分离。肌苷在酸、碱陛溶液中会发生降

13、解，在中性溶液中则较稳定。因此，为了使肌苷在溶液中稳定不分解，可加入含有磷酸盐的缓冲溶液，加热并调口H值为74，至少可保持6个月之久。利用肌苷该性质可较长时间保存待分析检测的肌苷样品，需要时再将样品的pH值调至测试所规定的酸度值进行肌菅含量13qN定，以满足分析工作中的某些需要。在酸眭溶液中，肌苷降f挥的产物为次黄口票呤和D-核糖，该反应被认为是酸眭催化1，前言水解。在减眭溶液中，肌昔发生三个竞争反应。温度升高，反应速度明显加快。该三 个竞争反应及酸幽撇解反应在日n着工业生产过程中都会发生，是造成肌苷降解损失的主要原因。因此在肌苷发酵液调至酸性后，应尽量缩短其停放时间，以减少酸胜降解损失；在肌

14、苷溶液蒸发浓缩过程中，工业E采用提高真空度的方法，以阿氏其蒸发温度，同时尽量缩短蒸发时间，使月n苷在碱性溶液中的降解损失减少到黾低值【2】。由于肌苷分子中的碱基含有共轭体系，所以肌苷分子能吸收紫外光。当溶液DH值在36时，肌苷在紫外最大吸收波长为2485nm，最大摩尔吸光系数为12250；当溶液pH值为112时，最大吸收波长为253nm，最大摩尔吸光系数为13100；当溶液中含2N HCI时，最大吸收波长为251ran，最大孽尔吸光系数为109001”。根据以上吸光特|生，可定性或定量分析检钡4肌苷。12肌苷的用途在食品方面，肌营是5 7肌苷酸的前体，而5肌营酸是食品工业中重要的助鲜剂。可与鸟

15、苷酸、谷氨酸钠以一定比例混合制成复合鲜味剂一一强力味精，对传统味精的升级换代起重要作用。肌苷可直接透过细胞膜，进入体细胞内，使处于低能缺氧状态下的细胞荻复正常水平，继续进行新陈代谢，并能活化丙酮酸氧化酶类，参与人体细胞蛋白质的合成，具有激活细胞、刺激代谢等良好作用。当细胞内ATP含量显著或持续下降时，细胞功鲥氐下，此时细胞进低自罄陕态，ATP的加入可以解除i新州聂能状态。但瑚P不能透过细胞膜，而日n若对细跑有高度的渗透陉，因此，肌苷是唯代替、体增加ATP的药物。月n营进入细胞后生成丙酮酸，丙酮酸可分解为辅酶A和乳酬”】。肌苷的医用价值较广泛，主要应用于心脏疾病、肝脏病、白血球减少症、放射陛照射

16、病、贫血病、血吸虫病、视网膜炎、神经萎缩、毛地黄中毒等症。日月昔还可以制成肌苷二醛、异丙肌苷，对精巢t皮瘤、麦粒细胞癌以及某些病毒性疾患都可以起缓解或抵抗作用，还可以制造干扰素的诱导剂。其毒副作用小，安全勤于，也是预防肝炎、心血管疾病等多种疾患的良好保健药品。肌苷除作为药用外，以它为起始原料，可以合成多种抗病毒药。病毒唑是由肌育衍生出的抗病毒药，近几年发展很怏。无环鸟苷是第二代新型广谱抗病毒药，是我国规划重点发展的抗病毒药物之一。我国首刨了以肌苷为原料合成无环鸟苷的工艺路线。从日n营取得次黄嘌呤，然后合成乙酰鸟苷进而合成无环鸟苷。异丙腮若是一个潜在开发的肌菅衍生物，它除了具有抗病毒作用外，同时

17、具有延缓衰老和增强i己忆的作用，也是一种延缓衰老的保健用药。2，3，双脱氧肌苷(DDI)是新开发的以肌苷为前体物的艾滋病治疗药物，在美国已正式上市【叼。13肌苷的测定方法圈肌苷的分离测定方法有离子交换法、纸层析法、纸电泳法、薄层色谱法、高压液天津科技大学硕士学位论文相色谱法等方法。这些分离定量方法各有利弊，如高压液相色谱是一种高效能的方法，时间短，需样量少，分析时间短，但仪器昂贵，难于普及；离子交换、纸层析、纸电泳等分离定量方法，灵敏度稍差，时间长，但历史悠久，设备简单，操作方便，只要选择好适当的分离条件也可达到要求，应用较广泛。131离子交换法分离测定肌苷离子交换柱层析是根据物质的酸碱度、极

18、性和分子大小的差异而予以分离的技术。应用离子交换层析技术分离测定核酸类物质，是由科恩等开发的。现已作为准确可靠的标准方法而被广泛采用。既可以应用强碱l生阴离子树脂以硼酸缓冲液分离发酵液中的朋昔和次黄嘌呤，也可以应用强酸性阳离子交换树脂用醋酸或盐酸淋洗液梯度洗脱分离提纯肌苷。132高压液相色谱法分离测定肌苷高压液相色谱的特点是采用长而细的层析柱，柱内填充物的粒度较细，在 30-lOOkgcm2的高压下操作，具有分辨力高、分椰惠度点。适用于核酸类物质的分离分析，可在几分钟到几十分钟的短时间内定量分离011匝g的样品。核苷类物质的分离所用吸附剂为薄膜阳离子交换剂，洗脱缓冲液为甲酸铵或磷酸二氢铵溶液。

19、国内应用I-IPLC方法测定朋若含量的研究也有重要进展，具体方法见文献w。133酶法分析铡定肌苷使用酶法分析测定核酸类物质，即使样品中混杂有异构体或结构类似物之类的物质，也能利用酶的底物专性而区别定量。而目酶法分析还有能够同时定量分析多种待测物质的优点。但是在酶法分析中，有时需将样品稀释几百倍乃至几千倍后再j撕亍测定，其分析结果受测定的紫外吸光度变化的微小误差的影响甚大，故定量和测定操作需小心进行。酶去测定日n苷使罔核苷磷酸化酶和黄嘌呤氧化酶，由肌昔生成次黄嘌呤，进而生成黄嘌呤，最后生成尿酸进行测定10】州l。134纸层析法分离测定肌苷纸层析法是以滤纸为惰性支持物，利用各种物质不同的分配系数，

20、使混合物随流动相通过固定相时而予以分离的方法。由于其设备简单、价廉、所需样品少、操作方便、分辨能力一般能达到要求等优点而被广泛采用。在肌苷的分析中，可以使用异丁醇：氨水，异丁酸：醋酸：氨水，正丁醇：醋酸：水等溶剂系统展层或双向纸层挢”】。135电泳法测定肌苷带电粒子在电场中向与其自身相反电荷的电极移动称为电泳，纸电泳是以滤纸为支持物的电泳方法，包括常压、高压纸电泳。纸电泳与纸层析一样，操作较简便，尤其是通过使用高压，大大缩短了分离时间。现在应用毛细管电泳法进行朋着含量测定也取得了较好的效果|13】【14】。136薄层层析法分离测定肌苷薄层尉i是将作为固定相的支持剂涂于支持板上而进行的一种层析技

21、术。核酸类物质的薄层层析是由兰德拉思开发的。与纸层析等分离定量方法相比，薄层层析具有1前言层析速度陕、分离效果好、分辨力高、不产生拖尾及斑点、扩蘸则、等优点而被广泛采用。有采用MN一纤维素EAE的薄层，以0L、05N盐酸为展开溶剂分离了碱基、核苷和脱氧核苷。14肌苷的生产方法及生产概况肌苷生产方法有化学分解法和发酵法两类，但目前在工业生产上实施的只有发酵法。发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累肌苷，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。141肌苷的生产方法1411化学分解法核苷类物页可用核糖核酸的化学分解法生产。用化学分解法分解RNA生产核苷的反应，基本上是磷酸二酯的加水分解反应

22、。由于RNA是单核苷酸通过3，5磷酸二酯键连接而构成的，核苷酸为核苷的磷酸酯，故为了通过加水分解RNA来生产核苷，需要切断核苷5'-OH和3'-OH位上结合的磷酸二酯键，并目进步建立核苷不再分解的条件。由于工艺复杂、收率f氏、成本高等原因，在工业生产肌苷已不采用化学分解法，通常为发酵法吼1412直接发酵法直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需核苷的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及核苷结构类1以物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种核苷的目的。1413添加前体物发酵法添加前体物发酵法是利用核苷酸生物合成途径的补救途径，通过在

23、肌苷生产菌的培养基中添加前体物次黄嘌呤，使嘌呤碱基通过补救途径直接合成核苷，从而增加肌苷的生成量。142肌苷的生产概况对肌苷等核酸类物质的研究不过几十年的时间，但取得了举世瞩目的成果。其研究起源于日本，1913年小玉新太郎等发现干松鱼的鲜味是肌苷酸的组氨酸盐，紧接着国中等人阐明了Y-IMP、5'-GMP的呈味J生。最初，人们从一些天然物质中提取制备肌苷酸!(：5一。先从蛇毒、小肠粘膜提取蛇毒陡磷酸二酯酶，用该酬哿核酸中的AMP分解成游离状态的Y-AMP，然后脱氨生成5-IMP。后来，又从干鱼、乌贼肌肉中提取闺曙再生成Y-IMP。但是这样的方法材料不易大量采取，产量很小，无法进行工业化生

24、产。1960年，国中、大村和绪方等砂酵母中提取RNA再酶解生产5'JMP，创立了所谓二步发酵法畸，实现了工业化生产。此方法的缺点是工艺复杂、收率低、成本高。伴随着二步发酵法的工业化生产，丌始了对不经过RNA制备阶段的一步发酵法天津科技大学硕=学位论文的研究。首先，罔林等、有马等、古屋等、中山等经过大量的研究实践发现，野生型菌株积累核酸类4颁的能力都很低，于是人们开始将注意力转向利用生化突变株生产核酸类物质的研究。1957年，戈斛17J和帕特里奇掣1目先后发表了利用大肠杆菌和粗糙脉孢霉的腺嘌呤缺陷型菌株能在培养液中积累次黄嘌呤的报导，开刨了选育用于直接发酵法生产核酸类物质的突变株的新纪元

25、。1961年，Uchidatl91等首先报导了从Bacilius菌种的突变株来获得肌苷。Aoldml腺嘌呤缺陷型BsubtiIis为出发菌株进行诱变，得到并分离出多重营养缺陷型突变株，其中C-30(ade，his-，廿n被发现具有低的肌苷分解活力，能够积累63mgml肌苷。1967年，Nogami等从亲株BacilluspNo 102得到一个具有腺嘌呤抗性的突变株，肌昔累计达到117m咖l；随后获得具有低的核苷磷酸化酶活性的突变株，其同时积累的嘌呤碱基的量是可以忽略的。Shiio等从Bsubtilis RDA-16中获得具有抗低水平8-氮乌嘌呤的突变株，它需要腺嘌呤，并且缺乏腺嘌呤脱胺酶活性，

26、发现其中一个突变株的PRPP转酰胺酶不被嚎嘌呤所抑制，能够积累18mgml的肌苷。Enei等发现具有高的核苷酸酶活性的Bsubtilis AL 11044可以产肌苷209L。Matsui等同样发现核苷酸酶活性在叽苷积累中具有重要的作用，1980年得到苏氨酸挠|生的Bsubtilis AL 11374，可以积累159L的肌昔，而其亲株只能积累099L肌苷。Miyagawn等通过NTG诱变得到的BsuboJis IFO 14189可以积累18罾E的肌苷。嘌呤核苷发酵是典型的代谢控制发酵，不仅优良的生产菌株选育是日n昔发酵的关键，而且由于任何菌株最终都必须落实到反应器水平的发酵控制才能应用于实际生产

27、。因而，发酵条件的控制对产苷也至关重要，甚至成为生产上影响产苷的主要因素。关于i匿冈搅拌剁斗对发酵的影响进行了大量的研究。A出等发现摇饭发酵中肌苷积累的最适氧吸收速度系数趔为78×104moUatmm1min，随后的放大中提出以氧传递速率为依据调整空气流量和搅拌转速，通过维持相当成功地将摇瓶条件放大到50M反应器规模。Shibai21删等通过一系列研究发现枯草杆菌发酵生产肌苷时，通风不仅起到供氧的作用，而且还具有降附著养液COz分压的作用，培养基的高CO：分压对叽苷发酵有抑制作用，所以即使在供氧充分的条件下，若通气量小起不到应有的换气效果，肌昔的积累也会受到抑制。国内围绕影口铲苷的工

28、艺进行了大量的研究，张克旭掣船】通过均匀设计对培养基成分、初始pH值、菌龄、通风、温度、温度对产茜影响的研究，得到了较好的产萤得率。吴先道等人认为不同发酵时期通过控制相应的排气C02量调节发酵通风量有利于肌苷积累，对生产有指导意义；李崇等研究了通气、搅拌、接种量及jf【力口补糖对产苷的影响；王梦鹤等通过在2L发酵罐中调节通风和转速条件优f艺工艺使产苷提高约25；陈文元、李永刺14J等分别对肌苷发酵与分离耦合过程的优化条件进行了探讨，研究表明该法与f可歇发酵相比能显著提高产南峦率和产苷率。此外，已知补救途径在发酵过捌空制中也司发挥重要作用。1965年，1an0F25唧提出补救途径螭埽；枯草芽1前

29、言孢杆菌将外部添加的次黄嘌呤转化为肌苷的能力。陈家平等利用枯草芽孢杆菌7171-91菌株，在摇瓶中进行添加次黄嘌呤试验，结果表明，添加1-5的次黄嘌呤均有利于肌营的积累，在发酵罐中添加l的次黄嘌呤使日n苷产量增产达30。庄贤军、钱铭镛等也证实培养基中添加次黄嘌呤可显著提高产苷。此外，徐海等在静息培养系统和20吨发酵罐E都证实翘雠拧忝加次静票呤可使朋苷得率得到提高。15肌苷的生物合成途径及其代时调节机制嘲肌苷的生物合成途径及代i身f调节机制是定向选育肌苷生产菌的理论基础。1959年，Buchanan等首先利用鸽肝匀浆研究了核苷酸的生物合成途径。接着，Hartman、Most、Magasanik等

30、又对此进行了大量研究。现已基本阐明枯草芽孢杆菌肌营生物合成途径及代谢调节机制，并预测了朋苷生产菌的定向育种途径。151肌苷的生物合成途径 核苷酸的生物合哟黼两条，一条是利用葡萄糖等碳源和氮源，以5i磷酸核糖为出发物质的全合成途径(denovopathway)，一条是由嘌呤碱基由于核糖基化及磷酸化而合成的补救途径(salvagepathway)。Nishikawa等对枯草芽孢杆静票呤核苷酸的生物合岗鑫径的研究结果表明，葡萄糖经HMP途径生成5'-磷酸核糖，从5埔酸核糖经过11步酶促反应生成肌苷的直接前体物IMP。IMP再经脱磷酸化转化为肌苷。同时在枯草芽孢杆菌中，从IMP开始分出两条环形

31、路线：一条是经过XMP合成GMP,再经GMP还原酶的作用生成IMP；另一条是经A立SAMe合成AA佃，再经过AMP脱氨酶的作用生成IMP，从而实现AMP和GMP的相互转变。在枯草芽孢杆菌中，嘌呤核苷酸的全合成途径如图1-1所示。由此可见，IMP是肌苷的直接前体物，IMP由全合成途径生成后，再经脱磷酸化即转变为肌昔。-6i堡!垄盔兰堡圭兰堡堡苎一拔蒲器鼢OH PRj干音戒礴 OH零。娑PRPP引黼= 。转蔬艘酶 6H b占。磷酸_蔓搪熊磷靛ff壤PPw”如蔷 篓良。争“”qnM一·。刚张=：眙螨“。fNH()=tV阿)j。碡酸梭搪瞎rPRA)甘氟盛+A1pADp+HP(监。Ni，N】o

32、甲。THF+眦OTH譬。oo1：，·=-一 辩艘接蛞甘氟礴转转甲蹴謦甲酰甘氰瞧辖括背缓fFGAR)”： (】(虻一H，N80H。ji：ii瓦iiH：N一 盘一5钮崔味畦核拌醴rAfR)s-氯莲一4·甲酸噼唑丰薹苷酸(CAIR)嘞0l坪化脱水爵t IMPd幽 hy蚓”)5二矾苷醵(5"-fMPjCXE挺丁坶二二5甲最胺-4-氰甲酰眯唑棱替融(FAIcAR)r铽髋鞍技瞽酸(GAR)0()C57栽蓦-4。(_一骁珀基)代铽审酰睬矬核苷酸(SAICAR)l馏鬻k反二：啦ofH±N，C、(：N州0N HiNC、，cH知岣 昧鑫辫器是畚，AMp GMP图卜1嘌呤核苷

33、酸的全合成途径瞻11 Denovopathwayofpurineril=，0nuclcotidebiosynthb7o函心、奠 “醚_菪 挈?瞄 专佣。P矿、MI州姐吣 孽一 州1前言此外，在肌苷的发酵生产中，补救途径亦具有重要的功能，当全合成途径受阻时，微划勿可通过j笏辑睐合廊獭着酸。嘲途径也；际分段合髓姑豆B铪届遴径，是旨微生物从培养基中取得完整的嘌呤或嘧啶，和戊糖、磷酸通过酶促反应直接合成单核苷酸。与补救途径有关的酶包括核苷磷酸化酶(碱基+R_1-P一核苷+Pi)、核苷酸焦磷酸化酶(碱基+PI岍，一51一核昔酸+P峨)和核苷酸磷酸激酶(核苷¨江P5i核苷酸+ADP)。其中最为重

34、要的是核苷酸焦磷酸化酶所催化的反应。枯草芽孢杆菌能利用外部添加的次黄嘌呤，通过核苷酸焦磷酸化酶的作用，使嘌呤日或基与PRPP合成为相应的嘌呤核苷酸。肌苛生物合成的补救途径如图1-2所示。核苷酸 p核苷ADP ATP图1-2嘌呤碱基、核苷和核苷酸的相互转变的补救途径lVlg1-2 SalvagepathwayoftranformamonglmrinebasBribonudeosideandn'bonuclcofide152肌苷合成的代谢调节机制对枯草芽黼：菌的研究结果表明，在AMP生物合成途径中专性酶(SAMP合成酶)仅受AMP系物质的反馈阻遏，GMP生物合成途径中专性酶(IMP脱氢酶)

35、仅受OMP系物质的反馈阻遏，与AMP、GMP合成共用的IMP生物合成有关的酶(IMP转甲酰酶、SAMP裂解酶、P砒甲转酰胺酶)受AMP系、GMP系任物质的反馈阻遏。另外，嘌呤核苷酸生物合成途径中的关键酶有PRPP转酰胺酶、IMP脱氢酶和 SAMP合成酶。其中，唧转酰胺酶特异煅Ah佃、ADP的完全反馈抑制，但也受IMP、GMP、XMP和ATP的抑制，不过抑制程度较弱。IMP脱氢酶受GMP最强的反馈抑制(58)，其次是如=P GO)、XMP(39)、GTP(26)的反馈抑制。综合上述结果，枯草芽孢杆菌中嘌呤核苷酸生物合成的调节机制是，在AMP的生物合成中，PRPP转酰胺酶受AMP的反馈抑制，IMP

36、生物合成系的酶和AMP生物合成系的酶受腺嘌呤系化合物的反馈阻遏。在GMP的生物合成中，IMP脱氢酶受GMP的反馈抑制，IMP生物合成系的酶和GMP生物合成系的酶受GMP的反馈阻遏，从IMP合成AMP、GMP，倾向于优先合成GMP。天津科技大学顼士学位论文PRPP+台成途径优先合成反馈抑制反馈阻遢p图1-3枯草芽孢秆菌中嘌呤核苷酸生物合成的调节机制Fig1-3 M曲Ib0艋cl鼬蚰nn搬由aIl劬ofpu豳eb0Il嘴k嘣deiIl且捌酗治当培养基中腺嘌岭和鸟嘌呤过剩时，腺嘌呤和鸟嘌呤便对P磁中转酰胺酶产生阻 遏作用，使萄潍通过补蝴合成嘌呤核苷酸。但是，补救甚陉也存舀玳谢调控问题。已知在枯草芽孢

37、杆菌中，补救途径中的酶核苷酸磷酸化酶、核苷酸焦磷酸化酶及核苷酸磷酸激酶等所催化的反应亦为多种嘌呤核苷酸所抑制，如XMP焦磷酸化酶受到GTP特别强烈的反馈抑制。16肌苷产生菌育种思路根据丰古草芽孢杆菌生物合成的代谢调节机制及成功的育种实例，肌苷生产菌的定向育种途径如下：161选择5-核苷酸酶活力强的菌株由5'-肌苷酸生成肌苷的反应由5'-核苷酸酶所催化，5一核苷酸酶活力强，则有利于5一肌苷酸转化成且门苷，从而使肌昔得以大量积累。实践表明，以具有一定产苷能力的枯草芽孢杆菌作为出发菌株，更有希望在短期内获得肌苷高产菌。162,切断支路代谢(1) 选育丧失SAMP合成酶的突变株，即腺嘌

38、呤缺陷突变株，可切断从IMP到AMP支g射啪十，通过限量；忝加腺嘌呤榴除腺嘌岭系化合物对m生物台成的反馈调节，增加肌苷前体物IMP的积累。(2) 选育丧失IMP脱氢酶或XMP氨化酶的突变株，即黄嘌呤缺陷突变株或鸟嘌呤缺陷突变侏，通过限量添加黄嘌呤或鸟嘌呤来解除鸟嘌呤系化合物对IMP生物合成的反馈调节，增加肌昔前体物IMP的积累。(3) 选育Ade一+X鲫或Ade一+Gu双重缺陷突变株，切断IMP到AMP和IMP到GMP两条支路代谢，通过限量控制腺嘌呤和黄嘌呤或鸟嘌呤来解除腺嘿呤和1前言鸟嘌呤系化合物对IMP生物合成的反馈调节，使IMP大量积累，从而使肌苷得以大量积累。(4) 选育硫胺素缺陷突变

39、株和组氨酸缺陷突变株，分别切断CAlR至I硫胺素和从AICAR到组氨酸的支咯f锄，加强主代谢漉，从而增加肌苷的积累。(5) 选育核苷磷酸化酶活力微弱或丧失的突变株，使生成的肌苷不再分解成次黄嘌呤。163解除菌体自身的反馈调节通过选育抗腺嘌呤、鸟嘌呤结构类似物如8AG、6-M1。、8"(r等与(或)抗磺胺类药物如SGr、S下等突变株，造就肌遗传上解除正常代谢调控的理想菌株。这是因为，菌体带上彳弋鞠封茜抗物抗陛标记后，一个可能途径是关键酶(如PRPP转酰胺酶)的结构基因发生突变，使关键酶的调节部位不再自跻口效应物结合，而滑陡中心部位却不变，因此当细胞中已有大量最终产物时仍能继续合崩亥产物

40、。另个可能途径是调节基因发生突变，使阻遏物不再能和效应物结合，因此当细胞中已有大量最终产物时，由于其不自邑与阻遥物相结合，故仍能继续合成有关的酶。在肌苷生产菌的选育中，常用的代谢拮抗物主要有8氮腺嘌呤、8氨鸟嘌呤、6_巯基嘌呤、磺胺胍、磺胶哒嗪、磺胺嘧啶等。164增加前体物的合成由于肌苷生物合成的最初前体物是5埘牾佥陔糖，所以选育丧失转酮酶活力的突变株，可以切断HMP途径中该酶所催化的反应，使5一磷酸核糖的积累增加，从而增加肌苷生物合成的主代谢流。选育转酮酶缺陷的方法是：选育不利用肛葡萄糖酸或L 阿拉伯糖等必须通过磷酸燃趟§新亍代谢的糖类的突变株，或者选育莽草酸缺陷突变株。总之，以枯

41、草芽孢杆菌为出发菌株，肌苷高产菌直该具有以下标记，即：Ade一+Xan一+His-+8-AG+SG+NP一-kSmr+dea-+GMPred-+Gu一。165睨苷产生菌育种实例1967年，百濑等、佐藤等、石井等对芽孢杆菌属嘌呤核苷酸生物合成的代谢调节机篇!Ji挂亍了深入的研究，发现了系列嘌吟核苷酸类物质的发酵机制。1969年，奈良、木下祝郎等对产氨短杆菌嘌呤核苷酸类物质的生物合成调节机制也进行了研究，为核酸类物质的发酵生产提供了理论基础，为肌苷生产菌的育种工作打下了坚实的基础。以后，陆续选出了许多肌苷生产菌株，包括枯草芽孢杆菌、短小芽融杆菌、产氨短杆菌及其他微生物等。19681980年枯草杆菌

42、No102经过紫外线照射和DNA转化法得到腺嘌呤和黄瞟呤双重缺陷型，并对8氮杂鸟嘌呤有抗l生的突变株(G3-46226)。突变株可以生成223岛几的肌苷，或在次黄嘌呤(1)存在下，生成331舀L的肌苷。1976年将产氨短杆菌突变株ATCC6872用NTG处理后，在涂布于含有6一疏基鸟嘌呤的培养基上，由此选出菌株ATCC21477。用各种阻遏剂及抑制剂孙童些突变株与天津科投大学硕士学位论文亲株进行比书猕疆睑。结果ATCC21477的IMP生物合成的酶系不受阻遏剂阻遏，也不受抑制剂的抑制。将ATCC21477再用药剂处理，获得腺嘌呤和鸟嘌呤双重缺陷型突变株衄CCl480，可产肌苷高达5249jL。

43、1973年，还选得了短小芽孢杆菌肌苷生产菌ASB-57418021，可产肌苷849L。恢菌是腺嘌呤、苏氨酸、组氨酸三重缺陷型。相比之下，我国的肌昔工业起步较晚，与先进水平有一定差距。但经我国科学工作者的努力，取得了很大的进展。1972年，中国科学院上海生化所以枯草杆菌No101为出发菌株选得具腺嘌呤、硫胺素缺陷型的菌株7171D1，产苷11659L281。1986年，复旦大学选得FD8601，在5L自控罐E发酵可产苷2659U凹3。1984年，江苏微生物研究胛划以717161为出发菌株，经诱变处理，获得一株具有腺嘌呤、组氨酸、硫胺索三重缺陷并对8-氮杂鸟嘌呤、6一巯基嘌呤具有挠f生的突变株JS

44、饵1019，该菌株摇20酽L。天津轻工业学院张克旭、陈宁等近来对日n苷萄粥是育做了大量研究，通过诱变、转化、融合等方法选得多株肌苷高产彦争矧，最高达2785扎。南开大学的王岳五、张蓓等将原生质体诱变技术蝴狞硼昔生产菌株的选育，证明非常有效【31l。17代谢工程与肌苷工程菌的构建代谢工程珏剀是指应用重组DNA技术和应用分子生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至产能体系的功能，以改进微生物细胞某些方面的代谢清生的整套工作(包括代谢分析，代谢设计，遗传操作，目的代谢活l生的实现等)。代谢工程的目标是修饰初级代谢，将碳架物质流导入目的产物的载流途径以获得产物

45、的最大转化率。随着代自扛程与各种学科知识的融合，越来越多的研究方法和策略被应用于代谢工程的研究。1、分子生物学方法构建特殊的基因转移系统，尤其对于具有较高生产价值的教生物，具有重要意义。例如在棒杆菌中，通过寻找土著质粒，利用不同的启动子构建特殊的载体，实现了外源基因在棒杆菌中的表达。2、分析化学及检测方法代谢工程的研究对象是代谢途径，因此必须对代谢通路中的些酶及产物进行研究和分析$倒。传统的分析通路的手段有：物质平衡、同位素标记、分离障碍突变株等，目前它们仍然是必不可少的手段，而核磁共振、流氏细胞术的应用则为这领域的发展增添了新的活力。3、数学及计算机工具研字科弋诩j工程不仅需要遗传学知识，而

46、且需要对宿主菌的生化代谢途径和生理学有深入的了解，所以有效地将DNA数据库的信息应用于代谢工程并开发出适合的软件系统，有利于代谢工程的发展。随着研究的深入，用整体系统观念来研究细胞越来越显得重要。相关的代谢工程1前言理谢姗91也在不断发展。新的检测手段及数学、计算机方法的应用，为人们提供了设计和改造微生物的条件，代谢工程为发展更为复杂的组织工程、基因治疗直至整个生命的工程奠定了基础。171基于代谢工程理论的肌苷工程菌构建的具体思路代i身工程的具体思路和常规诱变育种技术有所不同。(1)改变代谢流：改变分支代谢途径的流量，阻断有害产物。可采驳如下措施：a加速限速反应。通过克隆对生物合成起限速作用的

47、关键酶基因，加速代谢流的流动。b构建弋谢旁路。用代谓扭程的方法可以阻断或降f氏副产物的合成，特别是有毒产物的产生。c改变能量代谢途径。d改变分支代谢途径的流量。通过提高代谢分叉点的某一个分支代谢途径酶系的活力，以得到高产的末端代谢产物。(2)扩展代谢途径和构建新的代谢途径：通过引入外源基因，可以延伸原来的代谢途径，产生新的末端代谢产物，或者利用新的底物作为生物合成的原料，也可构建新的代_【9jj鑫径来合成具有新化学结构的代谢产物。a延伸代谢途径。b构建新的生物合成途径。1,'2肌苷工程菌的构建删从理论上讲，肌苷工程菌的构建策略有下列几种：第一，借助于基因克隆与表达技术，将肌苷生物合成途

48、径中的限速酶编码基因导入生产菌中，通过增加基因剂量和 (或)更换表达调控条件，扩增其表达。导入的限蠛因既可以是生产菌自身的内源基因，也可以是来自非生产菌(如大肠杆菌)的外源基因：第二，采取类似的方法，扩增表达jj1著输出系统的关键基因，或者降低某些基因产物的表达速率，最大限度地解除肌苷及其生物全合成中间产物对某生物合J$狯径可能造成的反馈抑制；第三，将多种完整的核苷生物合成操纵子导入另种核昔生产菌中，构建能同时生成两种甚至多种核苷的工程菌。实施L述战略的第一步是有关基因的克隆，特别是限速酶基因的扩增。生物体内负责催化从PRPP到IMP反应步§聚有10个酶，分别由put基因系列负责编码

49、，其中限速酶之一PRPP转酰8安酶是pufF基因的产物。在大肠杆菌中，pufF位于一个三基因的操纵子中，其它两个基因的功能尚不清楚：offl62zpurF-dedF。一个与启动子相邻的开放式阅读框(open reading fiame，D一负责编码一条162个氨基酸残基的肽链：dedF是操纵子的末端基因。启动基因位于35位和10位的基因之帆操纵子的位置在一26和一27位问变化，并且在操纵子位至少有一个是purF基因阻遏物作用的位点。在大肠杆菌细胞中伊受purR基因编码的阻遏物所调控，purR还负责编码调控朋rC，讲f也、purE、purHJD和purM基因的阳遏4驴”。12天津科技大学硕士学位

50、论文由于大肠杆菌被视为原核生物基因表达的典范，因此对枯草芽褂F菌中基因组合和调控与生物合成代谢的关系的研究较少。但是枯草芽孢杆菌中的基因类型和代谢途径等与肠道细菌的有所区别f42j。枯草芽孢杼菌中pur操纵子基因排列顺序为purEKBC(orf)QLMNH(J)D，如图1_4所示。箭头处为转录起始位点。转录起始于pure基因上游242bp处的一个643启动子，终止于purD下游约38个核营酸处。在大肠杆菌中，除了操纵子purH(J)D,purMN和purEK连缈p，其它操纵子不连续，因此，在大肠杆菌中IMP全台成途径的pur基因是分散的。而枯草芽孢杆菌中，它们处于一个 操纵子中。对枯草芽孢杆菌

51、中许多pur基因而言，3、端的某个编晌屿其相邻的下游5、端的编码序列均有重叠，如；purE-purK,8bp；purK-purB，4bp；purC-orf,8bp；or妈vurQ,4bp；purQ-p_cwL，17bp；purL-purF,25bp；purM-purN,4bp；以及purN-purH(J)，4bp。这样pur操纵子形成了三个基因组与一个米端基因：purEKBpurC(orJ)QLF-purMNH(J)-purD。割项反子间的距离分别为：purB-purC,73bp；purF-purM,lOlbp；purH(J)-purD,15bp。而大肠杆菌中的p计基因分散于染色体中，因此鼢见

52、到重叠的基因簇。0士 亡c乒=j3蔓二巴F二=毛了=f=乇=二二匕口u姑purK pu曲 pur亡 埘埔purl pufF Du巾 Pu氓 ¨rH CJ)purI图1_4枯草芽孢杆菌中删基因分布示意图F毽1-4scllema血d缸g嗡msoftheBacRussub础s pt时moperons枯草芽孢杆菌中的p"基因调控按照转录的终止-反终止模型进行(图15)【观1。图中第一条线表示在启动子(箭头所示)矛旺第一个结构基因位置之问的DNA区域。字母和箭头方向表示了基因的对称性。第二条线表示早熟的转录终止的mRNA。线上的圆形表示被鸟嘌呤核苷酸激活生成的调控分子，与A片段结合。

53、对称基因c和D可形成发夹结构，即a-独立转录终止子。第三条线为对称基因A和B形成的竞争l生的二级结构，去除转录终止作用。AB形成的该二级结构具有反终止子的作用。鸟嘌呤核苷酸抑制了酶的合成是由于在f独立转录终止位置形成了早熟mRNA，早熟的mRNA是在5端启动子区开始转录，在未进入结构基因区域就终止了转录。已证明腺嘌呤核苷酸是通过抑制转录的起始来发挥作用的。 亡二兰之兰兰三兰丽F一，；。，=。：，丑。， ：畦一图1巧枯草芽孢杆菌中叫”基因调控的终也反终止模型1前言一霹·1-5|l脚嗡雠唧代鲫【lta拄啦l 0tlhe扯m哪咖硼雠mI咖m0吐dforregulationoftheB础埘曲

54、p吖ope10uis由哒代谢调节机制可知，要构建8H苷工程菌株，就必须要满足下面一些条件：(1)具有有效的5-核苷酸酶。(2)将肌苷分解为次黄嘌呤的核苷酶活力低下或丧失。(3)解除菌体自身所受的代谢调控。(4)增加前体物，阻断代谢支路。因此，肌苷工程菌理想的生物合成途径应该如图1-6所示。OR5P8丹AMPtSAMP、 墨IR 寸忸怕Gm图1-6肌昔工程菌理想生物合成邕径n昏1-6 Idealbiosynthesispathwayofinosineengineeringstrain18肌苷的发酵控制【43】 -肌昔发酵是典型的代19控伟4发酵，刁邓虢良的生产菌栋选育是肌苷发酵的关踺，而且由于任

55、何菌株最终都必须落实到反应器水平的发孬控制才信钮凋于实际生产。因而，发酵条件的控制对产舒也至关重要，甚至成为生产上影响产营的主要因素。181碳源和氮源对产苷的影响碳源是构成菌体和合成肌苷的碳架及能量来源。氮源不仅是构成菌体蛋白质、核酸等含氮物质的来源，而且是合成肌苷碱基部分的来源。肌苷发酵的常用的碳源为葡萄糖、淀粉等，实验室常用碳源为葡萄糖；氮源可采用酵母粉、蛋白胨、玉米浆、豆浓等，实验室常用氮源为玉米浆、酵母粉、豆浓、硫酸铵、尿素等。培养基中糖浓度对肌苷发酵有很大的影响。在一定的范围内，肌苷的产量随糖浓度的增加而增加，但达到一定的限度，糖浓度过高，由于渗透压增大，14天津科技大学硕士学位论文对菌体生长和发酵均不利，当工艺条件配合不当时肌苷对糖的转化率反而降低。同时培养基浓度太大，氧溶解的阻力大，影响供氧效率，对发酵产苷不利。此外，在同