离体培养下的遗传与变异ppt课件

1、第三章 离体培育下的遗传与变异 Larkin和和Scowcroft1981提出把由任何提出把由任何方式的细胞培育所产生的植株统称为体细方式的细胞培育所产生的植株统称为体细胞无性系胞无性系somaclones，而把这些植株，而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异异somaclonal variation。 l 从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包从对生物遗传的影响而言，细胞工程技术本身即包含了双重性：遗传稳定性和变异性。含了双重性：遗传稳定性和变异性。l 对于单纯的繁衍技术而言，离体培育的技术操作是对于单纯的繁衍技术而言，离体培育的技术操作

2、是细胞或组织或个体的不断复制。然而由于起始培育细胞或组织或个体的不断复制。然而由于起始培育的资料、培育基成分以及培育时间的不同，使其产的资料、培育基成分以及培育时间的不同，使其产生的无性后代的遗传稳定性也有了一定差别，这些生的无性后代的遗传稳定性也有了一定差别，这些变异是由于在培育过程中产生的，属于随机性变异。变异是由于在培育过程中产生的，属于随机性变异。l 细胞工程还有一类技术操作，其目的就在于发明变细胞工程还有一类技术操作，其目的就在于发明变异，如体细胞人工突变、基因转移、体细胞交融等。异，如体细胞人工突变、基因转移、体细胞交融等。这些离体操作技术，在某种程度上说具有一定的目这些离体操作技

3、术，在某种程度上说具有一定的目的性和方向性，可以在短期内获得从自然界能够要的性和方向性，可以在短期内获得从自然界能够要经过几年乃至上百年的进化才干获得的性状，从而经过几年乃至上百年的进化才干获得的性状，从而加速了生物进化的进程。加速了生物进化的进程。 离体培育中的遗传与变异特点离体培育中的遗传与变异特点 体细胞变异的细胞遗传学根底体细胞变异的细胞遗传学根底 体细胞无性系变异诱导与选择运用体细胞无性系变异诱导与选择运用 体细胞变异的分子遗传学根底体细胞变异的分子遗传学根底 1 1 离体培育中的离体培育中的遗传稳定性遗传稳定性 2 2 离体培育下变异离体培育下变异 3 3 影响体细胞遗传与变异的要

4、素影响体细胞遗传与变异的要素 第一节 离体培育中的遗传与变异特点一. 离体培育中的遗传稳定性 l 离体培育的细胞学根底是有丝分裂，有丝分裂的离体培育的细胞学根底是有丝分裂，有丝分裂的DNA半保管复制和染色体的均等分裂机制，从实际半保管复制和染色体的均等分裂机制，从实际上可以保证离体培育物在普通情况下的遗传稳定性。上可以保证离体培育物在普通情况下的遗传稳定性。l 在准确选择培育方式的前提下，离体无性繁衍可以具在准确选择培育方式的前提下，离体无性繁衍可以具有较高的遗传稳定性有较高的遗传稳定性Phillip等，等，1994。正是基于。正是基于这一实际，利用离体培育技术建立了多种植物的无性这一实际，利

5、用离体培育技术建立了多种植物的无性繁衍体系。繁衍体系。 l 离体培育的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某离体培育的遗传稳定性表现的另一个方面是即使发生某些变异，只需根据需求选择适当的培育方式进展离体繁些变异，只需根据需求选择适当的培育方式进展离体繁衍，即可以淘汰或选择变异、或分别纯合体。衍，即可以淘汰或选择变异、或分别纯合体。l 离体培育下的变异均属于无性变异，即使变异发生，从离体培育下的变异均属于无性变异，即使变异发生，从个体的角度讲只会发生在少数性状上，因此，很容易从个体的角度讲只会发生在少数性状上，因此，很容易从群体中剔除变异个体，从而可以维持离体培育群体的遗群体中剔除变异个体，从而

6、可以维持离体培育群体的遗传稳定性。快速繁衍即是采用这一技术途径来坚持所繁传稳定性。快速繁衍即是采用这一技术途径来坚持所繁衍对象的种类典型性。衍对象的种类典型性。 l 变异也可以经过离体培育选择保管并快速纯化，这亦是变异也可以经过离体培育选择保管并快速纯化，这亦是离体培育遗传稳定性利用的途径之一。离体培育遗传稳定性利用的途径之一。 二. 离体培育下变异特点 变异的普遍性变异的普遍性变异的局限性变异的局限性特点特点嵌合性嵌合性部分植物离体培育再生植株的表型变异频率部分植物离体培育再生植株的表型变异频率植 物 种 类再生植株来源变异频率(%)烟 草体细胞愈伤组织10水 稻胚愈伤组织71.9甘 蔗幼叶

7、愈伤组织18玉 米体细胞愈伤组织14大 麦花粉植株10-15马铃薯叶肉原生质体100菠 萝冠芽愈伤组织7 腋芽愈伤组织34 幼果愈伤组织100l就单个变异体来讲，离体培育中变异性状往就单个变异体来讲，离体培育中变异性状往往是单一的，或少数几个性状的变异。往是单一的，或少数几个性状的变异。l分析水稻种子愈伤组织来源的植株变异显示，分析水稻种子愈伤组织来源的植株变异显示，在来自在来自7575个愈伤组织的个愈伤组织的11211121个再生植株中，个再生植株中，发生变异的植株，与供体种类比较只需发生变异的植株，与供体种类比较只需1 1个性个性状表现差别的占状表现差别的占7272，2 2个以上性状表现差

8、别个以上性状表现差别的只占的只占2828。l 然而就同一培育体系的再生群体而言，变异又具有多样然而就同一培育体系的再生群体而言，变异又具有多样性性 。l 黑云杉黑云杉(shan)P. mariana65个系的个系的7047个体细胞胚个体细胞胚植株和白云杉植株和白云杉P. glauca22个系的个系的3995个体细胞植株个体细胞植株的表型变异分析显示，虽然两个种的体细胞胚植株变异的表型变异分析显示，虽然两个种的体细胞胚植株变异频率分别只需频率分别只需1.0%和和1.6%，但分析发生变异的植株变，但分析发生变异的植株变异范围确较大，按形状变异即可分为异范围确较大，按形状变异即可分为9类，仅在矮化型

9、类，仅在矮化型变异一个性状上也表现出一系列程度上的显著不同，生变异一个性状上也表现出一系列程度上的显著不同，生长长45年后其植株高度呈现一系列变异类型，一些极度年后其植株高度呈现一系列变异类型，一些极度生长限制型矮化的株高只需几厘米，最矮类型的株高只生长限制型矮化的株高只需几厘米，最矮类型的株高只需需23cm， l 与有性重组相比，体细胞突变性状具有一定局限性与有性重组相比，体细胞突变性状具有一定局限性 l 从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主从表型上看，在不同植物类型中经常发生的变异主要是植株形状株高、叶形、叶色等、生长势、要是植株形状株高、叶形、叶色等、生长势、育性、某些抗性等性状

10、的变异。育性、某些抗性等性状的变异。l 从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢从生理生化特性上看容易出现同功酶谱、次生代谢的消长等变异。的消长等变异。l 一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。显性突变。 l 嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同嵌合性是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞，它是组织培育中常见的景象。的细胞，它是组织培育中常见的景象。 l 实践上，愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同实践上，愈伤组织在大多数情况下是一种具有不同染色体数和遗传变异程度不同的细胞组成的嵌合体，染色体数和遗传变异程度不同的细

11、胞组成的嵌合体，这些细胞各自进展不同步的分裂。这些细胞各自进展不同步的分裂。 硬粒小麦硬粒小麦(Triticum durum )6个无性系植株体细胞染色体数个无性系植株体细胞染色体数(括号外为个体数，括号内为染色体数括号外为个体数，括号内为染色体数)序号2n5811(7)737(1624, 26)768(29, 39, 40)422 35(17, 20, 23)111(33) 135(9, 11, 12)621(15,18,2127)333 43(7)14(16, 21, 22, 27)223 51(11)65(15, 22, 26)141(32) 62(12)118(18, 2026)211

12、(40) 2影响体细胞遗传与变异的要素 供供体体植植物物l 供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。供体植物的遗传背景对体细胞变异具有直接影响。供体植株原有的倍性程度在培育细胞多倍化过程中供体植株原有的倍性程度在培育细胞多倍化过程中起着重要作用，处于二倍体程度上的细胞比处于单起着重要作用，处于二倍体程度上的细胞比处于单倍体程度上的细胞较为稳定。倍体程度上的细胞较为稳定。 l 植物种内基因型间变异频率差别较大。植物种内基因型间变异频率差别较大。l TremblayTremblay等等19991999比较研讨黑云杉和白云杉体细比较研讨黑云杉和白云杉体细胞变异时也显示，黑云杉中体细胞变异频率最大

13、的胞变异时也显示，黑云杉中体细胞变异频率最大的基因型可达基因型可达57.657.6，而有些基因型变异率那么为，而有些基因型变异率那么为0 0。白云杉种内不同基因型的体细胞变异，变异率最高白云杉种内不同基因型的体细胞变异，变异率最高的基因型可达的基因型可达42.642.6，而有些基因型那么根本不发，而有些基因型那么根本不发生变异。生变异。 谷子体细胞无性系R2的变异频率基因型R2株系数未变异株系变 异 株 系总 变异株 系数稳定变异分 别 变异豫谷1号豫谷5号高39郑407冀谷14号C445矮宁黄210120170121557010020110415211039478395.786.789.49

14、0.970.967.183.0053340604.282.57.306.09111581223114.39.18.86.621.832.911.04.313.310.69.129.132.917.0l 以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体植物的典型性，体细胞变异频率很低。植物的典型性，体细胞变异频率很低。 l 在分化组织中，由于细胞分化过程中的核内有丝分在分化组织中，由于细胞分化过程中的核内有丝分裂或核内复制，其结果是在活体内组织分化期间就裂或核内复制，其结果是在活体内组织分化期间就会出现体细胞多倍性。在植物体内，这些多倍性细会出现体细胞多倍

15、性。在植物体内，这些多倍性细胞在正常情况下不再发生分裂以维持正常分化细胞胞在正常情况下不再发生分裂以维持正常分化细胞的功能，然而在离体培育条件下，培育基中的激素的功能，然而在离体培育条件下，培育基中的激素以及培育环境，就有能够刺激这些多倍性细胞分裂，以及培育环境，就有能够刺激这些多倍性细胞分裂，进而分化构成多倍体植株。进而分化构成多倍体植株。 l 普遍以为，培育方式、激素以及其它附加成分均会诱导体细胞变普遍以为，培育方式、激素以及其它附加成分均会诱导体细胞变异的发生，由于离体培育本身能够即是一种变异诱导的过程。异的发生，由于离体培育本身能够即是一种变异诱导的过程。l 培育基激素浓度和不同激素配

16、比对再生植株的染色体倍性有一定培育基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定影响。影响。l 在豌豆根段培育物和细胞培育中发现，在豌豆根段培育物和细胞培育中发现， 2 2，4 4D 0.25 mgL-1D 0.25 mgL-1能能添加多倍体细胞的有丝分裂，减少二倍体细胞的有丝分裂，而高添加多倍体细胞的有丝分裂，减少二倍体细胞的有丝分裂，而高浓度浓度20 mgL-120 mgL-1那么能促进二倍体细胞的分裂。那么能促进二倍体细胞的分裂。l 在在0.02 mgL-10.02 mgL-1激动素和激动素和1 mgL-1NAA1 mgL-1NAA的培育基上建立起来的纤细单的培育基上建立起来的纤细

17、单冠菊幼苗愈伤组织，保管冠菊幼苗愈伤组织，保管8080天以后，其中多数细胞为二倍体，少天以后，其中多数细胞为二倍体，少数为四倍体。将这些愈伤组织转移到含不同激素程度的培育基上，数为四倍体。将这些愈伤组织转移到含不同激素程度的培育基上，发现其多倍体细胞的分裂频率不同。发现其多倍体细胞的分裂频率不同。0.02 mgL-10.02 mgL-1激动素和激动素和4 mgL-4 mgL-1 NAA1 NAA的多倍体分裂频率为的多倍体分裂频率为2020，而，而0.02 mgL-10.02 mgL-1激动素和激动素和1 mgL-1 1 mgL-1 NAANAA时的多倍体分裂频率为时的多倍体分裂频率为10010

18、0。出现这一景象的缘由能够是由。出现这一景象的缘由能够是由于多倍体细胞通常具有较强的环境忍受才干，可以经过一些自体于多倍体细胞通常具有较强的环境忍受才干，可以经过一些自体调理使细胞分裂。调理使细胞分裂。 l 激素除了引起染色体倍性的添加外，在一些培育中还发现激素除了引起染色体倍性的添加外，在一些培育中还发现染色体倍性减少的景象。初次报道培育过程中的染色体减染色体倍性减少的景象。初次报道培育过程中的染色体减数是在数是在1948年年Huskins，1948，以后一些研讨者在他们，以后一些研讨者在他们的任务中也相继发现这一景象，但有关体细胞倍性减数的的任务中也相继发现这一景象，但有关体细胞倍性减数的

19、资料还非常有限。顾蔚资料还非常有限。顾蔚1999在蚕豆组织培育中发现，在蚕豆组织培育中发现，体细胞染色体减数与运用极端的激素浓度有关，在他的实体细胞染色体减数与运用极端的激素浓度有关，在他的实验中不含激素的培育基其多倍体发生频率为验中不含激素的培育基其多倍体发生频率为6.31，在，在10 mgL-1NNA和和2.5 mgL-1KT的培育基中，单倍体发生频率可的培育基中，单倍体发生频率可达达13.03。 l 除了培育基的外源激素可以引起变异外，除了培育基的外源激素可以引起变异外，培育基的物理形状以及培育类型也会引起细培育基的物理形状以及培育类型也会引起细胞的变异。普通来讲，悬浮培育的细胞较半胞的

20、变异。普通来讲，悬浮培育的细胞较半固体培育的细胞易产生变异。固体培育的细胞易产生变异。 l 原生质体培育的体细胞变异大于细胞培育的变异，原生质体培育的体细胞变异大于细胞培育的变异，而细胞培育的变异又大于组织器官培育的变异。而细胞培育的变异又大于组织器官培育的变异。在细胞培育中，性细胞培育再生植株的变异要大在细胞培育中，性细胞培育再生植株的变异要大于体细胞培育的植株。马铃薯原生质体培育再生于体细胞培育的植株。马铃薯原生质体培育再生植株的变异到达植株的变异到达100100，而茎尖培育再生植株根本，而茎尖培育再生植株根本没有变异。没有变异。l 在因培育类型引起的变异中，不仅有染色体倍性在因培育类型引

21、起的变异中，不仅有染色体倍性的异常变异，同时基因突变、染色体构造变异、的异常变异，同时基因突变、染色体构造变异、以及非以及非DNADNA程度引起的变异亦相继添加。程度引起的变异亦相继添加。 l 由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植由继代次数引起的体细胞变异几乎在各种类型的植物中均有报道。普通来讲，继代时间越长，继代次物中均有报道。普通来讲，继代时间越长，继代次数越多，细胞变异的机率就越高。数越多，细胞变异的机率就越高。l 烟草继代培育烟草继代培育5 5年的愈伤组织，其再生植株与供体年的愈伤组织，其再生植株与供体基因型相比，几乎没有形状正常的植株。染色体分基因型相比，几乎没有形状正常的植

22、株。染色体分析显示，这些植株大多为非整倍体和多倍体。析显示，这些植株大多为非整倍体和多倍体。l 玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形状上玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形状上与供体基因型根本一致，但培育与供体基因型根本一致，但培育3 3年后愈伤组织的年后愈伤组织的再生才干显著下降，再生植株生长异常，细胞学分再生才干显著下降，再生植株生长异常，细胞学分析显示出染色体断裂和带型变异。析显示出染色体断裂和带型变异。 培育时间对掌叶半夏愈伤组织染色体变异的影响培育时间月察看细胞数亚二倍体二倍体多倍体和非整倍体细胞数细胞数细胞数13121892515083146152915.211.830.0

23、34.965392733 70.776.554.039.8967199.811.814.022.9第二节 体细胞变异的细胞遗传学根底 离体培育的体细胞变异，从本质上来说是细胞离体培育的体细胞变异，从本质上来说是细胞对环境压力的应对机制的调整。有学者以为，实现对环境压力的应对机制的调整。有学者以为，实现这一机制调整的始发点是放弃自然条件下的细胞学这一机制调整的始发点是放弃自然条件下的细胞学控制程序，重建新的细胞学控制程序，这种程序重控制程序，重建新的细胞学控制程序，这种程序重建的结果导致了染色体数量和构造的改动建的结果导致了染色体数量和构造的改动PhillipsPhillips等，等，19941

24、994。 DNA 反复复制反复复制染色体断裂与重组染色体断裂与重组非正常有丝分裂非正常有丝分裂一.DNA核内反复复制(endoreduplication l DNADNA反复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数添加，构反复复制但不发生细胞分裂，其结果是染色体组数添加，构成同源多倍体。假设这种成同源多倍体。假设这种DNADNA反复复制多次发生，细胞内反复复制多次发生，细胞内DNADNA含量含量就会不断上升。就会不断上升。l SalonSalon和和EarleEarle19981998在硬粒小麦在硬粒小麦(Tripsacum dactyloides)(Tripsacum dactyloides

25、)的的非成熟胚培育中察看到，存活的再生植株均为二倍体和四倍体，非成熟胚培育中察看到，存活的再生植株均为二倍体和四倍体，加倍后的植株在形状和发育方面均很正常。加倍后的植株在形状和发育方面均很正常。 l DNADNA的核内再复制在有些情况下可以反复进展。的核内再复制在有些情况下可以反复进展。l D DAmatoAmato等等19801980报道，红花菜豆报道，红花菜豆Phaseolus coecineuPhaseolus coecineu，2n2n2222幼胚离体培育构成的愈伤组织，正常二倍体细胞只占二分幼胚离体培育构成的愈伤组织，正常二倍体细胞只占二分之一，由于之一，由于DNADNA核内多次复制

26、，有的细胞核内核内多次复制，有的细胞核内DNADNA值到达值到达128c128c。 l 一些中间类型的倍数性的构成，有研讨以为能够是由于一些中间类型的倍数性的构成，有研讨以为能够是由于DNADNA经过经过反复复制后，在以后的复制中出现非同步复制或核交融所致。如反复复制后，在以后的复制中出现非同步复制或核交融所致。如第一次第一次DNADNA复制没有发生分裂的复制没有发生分裂的4n4n核，在以后的分裂进程中，与核，在以后的分裂进程中，与正常分裂的正常分裂的2n2n核发生交融，从而构成六倍体张冬生，核发生交融，从而构成六倍体张冬生，19891989。 硬粒小麦中胚轴培育中硬粒小麦中胚轴培育中DNA值

27、的变化值的变化培育天数培育天数不同不同DNA值细胞比例值细胞比例2c2c4c8c0 88.311.7 5 80.716.82.5134.879.56.69.1179.781.57.90.9l 近年研讨显示，近年研讨显示，DNADNA核内反复复制的发生与细胞分裂周期的核内反复复制的发生与细胞分裂周期的调控有关。在离体条件下，一些进入调控有关。在离体条件下，一些进入S S期的细胞，在完成期的细胞，在完成DNADNA复制后不进入下一阶段完成分裂，从而使细胞内复制后不进入下一阶段完成分裂，从而使细胞内DNADNA值和染值和染色体倍性添加一倍。这种细胞进入间期后又开场色体倍性添加一倍。这种细胞进入间期后

28、又开场DNADNA合成，合成，假设分裂能正常进展，那么由此而产生的细胞即为四倍体。假设分裂能正常进展，那么由此而产生的细胞即为四倍体。假设分裂依然不能进展，那么假设分裂依然不能进展，那么DNADNA值和染色体倍性就会再添值和染色体倍性就会再添加一倍，从而使细胞内加一倍，从而使细胞内DNADNA值和染色体倍性成值和染色体倍性成2n2n方式添加。方式添加。l 玉米胚乳和子叶发育研讨显示，玉米胚乳和子叶发育研讨显示，DNADNA反复复制能够与反复复制能够与M M期的不期的不同同CDKCDK活性有关，而此时的活性有关，而此时的CDKCDK活性又遭到磷酸化和去磷酸化活性又遭到磷酸化和去磷酸化的影响。同时

29、，在玉米中还发现了的影响。同时，在玉米中还发现了CDKCDK的抑制子的抑制子CKICKI，DNADNA核核内复制经过内复制经过CDKCDK的调控在动物发育和病理细胞中已被证明。的调控在动物发育和病理细胞中已被证明。因此，因此，LarkinsLarkins等以为，这一机制能够是等以为，这一机制能够是DNADNA核内反复复制的核内反复复制的重要调控途径。重要调控途径。 l 拟南芥髓组织、成熟叶片以及托叶细胞多倍体发生过程拟南芥髓组织、成熟叶片以及托叶细胞多倍体发生过程的研讨显示，一个在的研讨显示，一个在G2期表达的期表达的CDK基因基因CKS1At参与参与调理了调理了DNA反复复制过程反复复制过程

30、Jacqmard等，等，1999。此。此外，外，Cebolla等等1999在他们的研讨中发现，一个与在他们的研讨中发现，一个与Cyclins降解有关的基因降解有关的基因ccs52也与也与DNA反复复制和多倍反复复制和多倍体细胞产生有关。现有资料显示，体细胞产生有关。现有资料显示，DNA的核内反复复的核内反复复制能够涉及到一些与细胞周期调控基因的开启与封锁。制能够涉及到一些与细胞周期调控基因的开启与封锁。 二二. . 染色体断裂与重组染色体断裂与重组染色体构造变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断染色体构造变异是体细胞变异的另一重要类型。染色体断裂与重组是离体培育中染色体构造变异的主要缘由之一

31、，裂与重组是离体培育中染色体构造变异的主要缘由之一，也是体细胞变异中经常发生的景象，其细胞学特征是分也是体细胞变异中经常发生的景象，其细胞学特征是分裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体裂中期出现断裂的染色体片段、落后染色体以及染色体桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位桥，其结果是在体细胞中出现染色体易位、缺失、倒位等多种类型的构造变异。等多种类型的构造变异。 染色体桥落后染色体l 近年的研讨以为，染色体断裂与近年的研讨以为，染色体断裂与DNADNA甲基化程度有关。添加甲基化程度有关。添加DNADNA甲基化，亦会引起染色体断裂。分析以为，甲基化程度甲基化，亦会引起染色体断

32、裂。分析以为，甲基化程度的添加能够抑制的添加能够抑制DNADNA的复制效率，使得的复制效率，使得DNADNA复制不能同步，从复制不能同步，从而呵斥后期桥的产生和染色体的断裂。而呵斥后期桥的产生和染色体的断裂。l 染色体构造变异既可发生在愈伤组织细胞中，也可发生在再染色体构造变异既可发生在愈伤组织细胞中，也可发生在再生植株中，有时在一些再生植株的有性后代中也能察看到。生植株中，有时在一些再生植株的有性后代中也能察看到。l 产生染色体构造变异的再生植株普通生长不正常，生活力低产生染色体构造变异的再生植株普通生长不正常，生活力低下，很难长期生存，因此以保管种质资源为目的的离体培育下，很难长期生存，因

33、此以保管种质资源为目的的离体培育应尽能够防止这种变异发生，以免呵斥基因资源流失。应尽能够防止这种变异发生，以免呵斥基因资源流失。 三. 非正常有丝分裂 l离体培育中，染色体除了整倍性变异外，还离体培育中，染色体除了整倍性变异外，还可察看到大量的非整倍性变异，这种愈伤组可察看到大量的非整倍性变异，这种愈伤组织往往分化才干低下，再生植株大多生长不织往往分化才干低下，再生植株大多生长不正常，有性繁衍遗传稳定差。正常，有性繁衍遗传稳定差。l 纺锤体构纺锤体构成异常使成异常使得有丝分得有丝分裂不正常裂不正常是其缘由是其缘由之一。之一。 l 核裂经常导致双核与多核细胞的出现。在红花菜豆核裂经常导致双核与多

34、核细胞的出现。在红花菜豆的胚培育愈伤组织中，双核细胞有的胚培育愈伤组织中，双核细胞有7070有核裂景象，有核裂景象，蚕豆子叶诱导的愈伤组织细胞的双核和多核细胞出蚕豆子叶诱导的愈伤组织细胞的双核和多核细胞出现的频率也相当高。在核裂出现频率高的资料中，现的频率也相当高。在核裂出现频率高的资料中，多倍体、亚多倍体和非整倍体细胞的出现频率亦相多倍体、亚多倍体和非整倍体细胞的出现频率亦相应提高。应提高。 第三节 体细胞变异的分子遗传学根底 l 体细胞变异除了发生在染色体程度上，更多的是在基体细胞变异除了发生在染色体程度上，更多的是在基因程度上的变异。因程度上的变异。l 从利用体细胞变异的角度看，染色体变

35、异大多是一些从利用体细胞变异的角度看，染色体变异大多是一些畸形变异，真正可利用的染色体变异是非常有限的。畸形变异，真正可利用的染色体变异是非常有限的。l 基因程度上的变异在表型上大多只是个别性状的改动，基因程度上的变异在表型上大多只是个别性状的改动，不会影响再生植株的正常生长发育，因此，从再生植不会影响再生植株的正常生长发育，因此，从再生植株的这些变异中就有能够挑选出有益的变异。株的这些变异中就有能够挑选出有益的变异。l 基因程度上的变异从根本上讲就是基因程度上的变异从根本上讲就是DNADNA程度上的碱基突程度上的碱基突变或修饰形状的改动。变或修饰形状的改动。 碱基突变碱基突变DNA序列的选择

36、性序列的选择性扩增与丧失扩增与丧失转座子活化转座子活化DNA甲基化甲基化l 碱基突变是指碱基突变是指DNADNA序列中碱基的改动。序列中碱基的改动。l 突变碱基的突变碱基的DNADNA序列处于构造基因的位置或调控序列的序列处于构造基因的位置或调控序列的位置时，即可导致遗传形状的改动。位置时，即可导致遗传形状的改动。l 碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之一。碱基突变是产生体细胞变异的重要途径之一。 一. 碱基突变l 对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分别规律，这一点已在水定遗传而且符合孟德尔遗传分别规律，这一点已

37、在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证明。稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证明。 l BrettellBrettell等从等从645645株玉米杂种胚培育再生植株中，发株玉米杂种胚培育再生植株中，发现了一个稳定突变体现了一个稳定突变体Adh1Adh1乙醇脱氢酶突变体，克乙醇脱氢酶突变体，克隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码隆基因序列分析发现，该基因第七外显子中一个编码谷氨酸的谷氨酸的GAGGAG中的中的A A转换成为了转换成为了T T，使翻译肽链中的谷，使翻译肽链中的谷氨酸转变为氨酸转变为纈纈氨酸。氨酸。l 植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对植物的许多性状特别是经济性状

38、均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变能够由于技术上的复杂于多基因控制性状的碱基突变能够由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。 l 早在上世纪早在上世纪8080年代年代LarkinLarkin和和ScoworoftScoworoft即提出，即提出，DNADNA序列的扩增与序列的扩增与丧失也是体细胞无性系变异的缘由之一。丧失也是体细胞无性系变异的缘由之一。l 早期的研讨以为，早期的研讨以为，DNADNA值的改动与倍性变异是一致的。值的改动与倍性变异是一致的。l 但近年来的研讨显示，但近年来的研讨显示，DNADNA值的

39、变化是一个比较复杂的分子生物值的变化是一个比较复杂的分子生物学景象。当学景象。当DNADNA的的c c值以整倍性方式添加或减少时，其变化与染色值以整倍性方式添加或减少时，其变化与染色体倍性的变异是一致的。然而，有些体倍性的变异是一致的。然而，有些DNADNA值的变化却与倍性没有值的变化却与倍性没有直接联络，这种变化大多是直接联络，这种变化大多是DNADNA序列的选择性扩增或部分序列丧序列的选择性扩增或部分序列丧失呵斥失呵斥l 在原核染色体中，在原核染色体中，DNADNA的量或真核细胞中单倍体的量或真核细胞中单倍体DNADNA的量，称为的量，称为C C值；值；C C值与生物构造与组成的复杂性不一

40、致的景象，称为值与生物构造与组成的复杂性不一致的景象，称为C C值矛盾。值矛盾。l 离体培育下离体培育下DNADNA序列的选择性扩增包括两种情况，一是反复序列序列的选择性扩增包括两种情况，一是反复序列的扩增，二是基因的选择性扩增。的扩增，二是基因的选择性扩增。 二. DNA序列的选择性扩增与丧失l Lapitan等等1988以生物素标志的以生物素标志的480 bp反复序列反复序列DNA片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当代片段为探针，发现小黑麦杂种再生植株当代7R染染色体短臂端粒位置上的这种反复序列发生了选择性扩增，色体短臂端粒位置上的这种反复序列发生了选择性扩增，而且这种扩增可以遗传至少三代

41、。而且这种扩增可以遗传至少三代。l 在水稻、小麦等作物中也发现一些微卫星在水稻、小麦等作物中也发现一些微卫星DNA的扩增。的扩增。水稻悬浮培育细胞的水稻悬浮培育细胞的DNA分析发现，未分化的培育细分析发现，未分化的培育细胞中一些高度反复序列的扩增比供体资料高胞中一些高度反复序列的扩增比供体资料高75倍，而不倍，而不同种类的叶片这种扩增差别只需同种类的叶片这种扩增差别只需23倍。倍。l 亚麻卫星亚麻卫星DNA和小麦和小麦rDNA研讨中也有类似景象。研讨中也有类似景象。 l 基因的选择性扩增在植物个体发育中经常看到。离体培基因的选择性扩增在植物个体发育中经常看到。离体培育下的基因选择性扩增被以为是

42、细胞在短期内为满足某育下的基因选择性扩增被以为是细胞在短期内为满足某种需求而产生足够的基因产物的一种调控手段。种需求而产生足够的基因产物的一种调控手段。l 抗除草剂草甘磷的突变系就是一个典型的例子。草甘磷抗除草剂草甘磷的突变系就是一个典型的例子。草甘磷能抑制能抑制3-烯醇丙酮酸莽草酸盐烯醇丙酮酸莽草酸盐-5-磷酸合成酶磷酸合成酶EPSPs活性，抗草甘磷突变体那么具有较高活性，抗草甘磷突变体那么具有较高EPSPs活性。活性。DNA分析显示，这种突变体的分析显示，这种突变体的EPSPs活性提高是由于参与编活性提高是由于参与编码该酶的基因选择性扩增，添加了码该酶的基因选择性扩增，添加了mRNA程度，

43、从而添程度，从而添加了酶的含量。加了酶的含量。l Peter等的研讨显示，在烟草抗草甘磷的突变体中，至等的研讨显示，在烟草抗草甘磷的突变体中，至少有少有2个与个与EPSPs合成相关的基因发生了选择性扩增，合成相关的基因发生了选择性扩增，而且这些突变体在没有草甘磷选择压力存在的情况下仍而且这些突变体在没有草甘磷选择压力存在的情况下仍富含富含EPSPs mRNA。 l 在离体培育中，有时也会发生在离体培育中，有时也会发生DNA序列丧失的景象。序列丧失的景象。l 现有资料显示，现有资料显示，DNA序列丧失多发生在序列丧失多发生在rDNA及其它们及其它们的间隔序列，某些反复序列的间隔序列，某些反复序列

44、DNA区域也易发生丧失。区域也易发生丧失。l Landsmann利用利用DNA随机克隆首先在马铃薯中发现了随机克隆首先在马铃薯中发现了再生植株有再生植株有DNA片段的丧失，随后片段的丧失，随后Cullis和和Clary采用类采用类似的方法在亚麻再生植株中察看到似的方法在亚麻再生植株中察看到rDNA的减少。以后的减少。以后在大麦、小麦以及水稻的培育再生植株中均检测到在大麦、小麦以及水稻的培育再生植株中均检测到rDNA的减少。的减少。l DNA的减少不仅发生在核的减少不仅发生在核DNA中，也有发生在叶绿体中，也有发生在叶绿体基因组中。基因组中。l 一些一些DNA序列的减少只发生在愈伤组织构成阶段，

45、再序列的减少只发生在愈伤组织构成阶段，再生植株过程中又恢复到正常形状，目前还不清楚这种变生植株过程中又恢复到正常形状，目前还不清楚这种变化的生物学意义。化的生物学意义。 l 上个世纪上个世纪8080年代，年代，LarkinLarkin和和ScowcroftScowcroft首先提出，转座首先提出，转座因子的活化能够是体细胞无性系变异的缘由之一。因子的活化能够是体细胞无性系变异的缘由之一。l 由于培育中细胞快速分裂，异染色质复制滞后，引起细由于培育中细胞快速分裂，异染色质复制滞后，引起细胞分裂后期构成染色体桥和染色体断裂。在断裂部位的胞分裂后期构成染色体桥和染色体断裂。在断裂部位的DNADNA修

46、复过程中，位于异染色质区的转座子被活化继而修复过程中，位于异染色质区的转座子被活化继而转座，引起一系列的构造基因活化、沉默以及位置变化，转座，引起一系列的构造基因活化、沉默以及位置变化，呵斥无性系变异。呵斥无性系变异。l 我国学者朱至清以为，也能够是转座子在培育环境中首我国学者朱至清以为，也能够是转座子在培育环境中首先被激活而转座，从而呵斥染色体的构造变异。先被激活而转座，从而呵斥染色体的构造变异。 三. 转座子活化l Peschke等以玉米等以玉米Ac转座子检验系为母本，与转座子检验系为母本，与1200个由未成熟胚再生的植株进展测交，根据种子糊粉个由未成熟胚再生的植株进展测交，根据种子糊粉层

47、颜色色素的变化来确定再生植株中能否携带有活层颜色色素的变化来确定再生植株中能否携带有活化的化的Ac转座子，结果在转座子，结果在56株中检测出株中检测出Ac活化。活化。l 苜宿组织培育再生植株中也察看到因转座子活化所苜宿组织培育再生植株中也察看到因转座子活化所引起的花样变异。引起的花样变异。 l 利用利用Ds转座子系统进展异源转化，在一些作物中胜利察转座子系统进展异源转化，在一些作物中胜利察看到转座子插入的体细胞突变，从而证明转座因子确实看到转座子插入的体细胞突变，从而证明转座因子确实诱导了体细胞变异。诱导了体细胞变异。l Mckenzie等为了建立一个稳定的转座子标签体系，将等为了建立一个稳定

48、的转座子标签体系，将Ds/Ac转座系统导入球茎甘蓝中，获得的携带有转座系转座系统导入球茎甘蓝中，获得的携带有转座系统的转化植株，在离体培育下添加选择压力，挑选稳定统的转化植株，在离体培育下添加选择压力，挑选稳定的转座子插入突变，结果察看到在获得到的转座子插入突变，结果察看到在获得到42个个Ac切除切除的稳定的稳定Ds插入再生植株中，有插入再生植株中，有29个植株发生了个植株发生了Ds再转再转座。脚印分析显示，在座。脚印分析显示，在Ds Donor-site序列附近发生了大序列附近发生了大量的缺失和重组。量的缺失和重组。 l DNADNA甲基化在基因表达调控中具有重要作用。甲基化在基因表达调控中

49、具有重要作用。DNADNA甲基化甲基化和去甲基化，不仅能经过调控基因的表达与封锁来控制和去甲基化，不仅能经过调控基因的表达与封锁来控制生物的发育，同时也可以经过生物的发育，同时也可以经过DNADNA甲基化途径来顺应环甲基化途径来顺应环境对生物体的压力。境对生物体的压力。l 目前甲基化研讨主要利用目前甲基化研讨主要利用HpaIIHpaII和和MspI MspI 两种甲基化敏感两种甲基化敏感的限制性核酸内切酶进展比较分析。的限制性核酸内切酶进展比较分析。l HpaIIHpaII和和MspIMspI的酶切位点均为的酶切位点均为CCGGCCGG，当靠外的，当靠外的C C被甲基化被甲基化时，只能被时，只

50、能被HpaIIHpaII酶切，当靠内的酶切，当靠内的C C被甲基化时，只能被被甲基化时，只能被MspIMspI酶切，在普通情况下，与酶切，在普通情况下，与G G相邻的相邻的C C更容易被甲基化。更容易被甲基化。利用两种酶切片段的差别即可分析利用两种酶切片段的差别即可分析DNADNA甲基化的变化。甲基化的变化。 四. DNA甲基化l 离体培育再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞离体培育再生植株的甲基化变化首先在玉米体细胞无性系再生植株中发现。来自玉米幼胚再生植株的无性系再生植株中发现。来自玉米幼胚再生植株的某些无性系与供体相比发生了超甲基化，而另一些某些无性系与供体相比发生了超甲基化，而另一些再

51、生植株却只在与再生植株却只在与G G相邻的相邻的C C上发生甲基化，而且这上发生甲基化，而且这种甲基化在基因组中的分布不均匀。种甲基化在基因组中的分布不均匀。l 胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培育细胞或再胡萝卜、番茄、马铃薯等多种植物的培育细胞或再生植株中，均报道发现了因生植株中，均报道发现了因DNADNA甲基化改动而产生的甲基化改动而产生的体细胞变异。体细胞变异。 lKovaik等在烟草细胞悬浮系等在烟草细胞悬浮系“TBY-2培育培育中，察看到由于浸透压的改动，细胞中，察看到由于浸透压的改动，细胞DNA出出现了超甲基化的景象。现了超甲基化的景象。l在培育基中参与在培育基中参与NaCl或者甘

52、露醇提高培育或者甘露醇提高培育基浸透压，然后提取细胞基浸透压，然后提取细胞DNA检测检测DNA甲甲基化变化情况。结果发现，在烟草基因组的基化变化情况。结果发现，在烟草基因组的2个异染色质区个异染色质区HRS60和和GRS，其，其CCG三核苷酸反复区和三核苷酸反复区和CCGG四核苷酸反复区的四核苷酸反复区的C几乎全部被甲基化。当把细胞转移培育到几乎全部被甲基化。当把细胞转移培育到浸透压正常的培育基中时，浸透压正常的培育基中时，DNA甲基化程度甲基化程度又可恢复正常。又可恢复正常。 u除了除了DNADNA甲基化程度的添加外，离体培育中的某些变异甲基化程度的添加外，离体培育中的某些变异也为也为DNA

53、DNA甲基化程度的降低所致，最典型的例子是油棕甲基化程度的降低所致，最典型的例子是油棕体细胞胚植株的雄蕊雌性化变异。体细胞胚植株的雄蕊雌性化变异。 uRivalRival等发现油棕体细胞胚植株中，大约有等发现油棕体细胞胚植株中，大约有5 5的植株表的植株表现出雄蕊雌性化和完全不育。进一步研讨发现，产生这现出雄蕊雌性化和完全不育。进一步研讨发现，产生这种变异的愈伤组织有两种类型，一种是瘤状愈伤组织种变异的愈伤组织有两种类型，一种是瘤状愈伤组织NCCNCC，另一种是快速生长愈伤组织，另一种是快速生长愈伤组织FGCFGC。u来自来自NCCNCC的变异植株，在种植的变异植株，在种植9 9年后，一切植株

54、均可恢复年后，一切植株均可恢复正常。而来自正常。而来自FGCFGC的变异植株只需的变异植株只需5050能恢复正常。进能恢复正常。进一步分析显示，变异植株一步分析显示，变异植株DNADNA甲基化程度分析显示，来甲基化程度分析显示，来自自NCCNCC的变异植株，的变异植株，C C的甲基化率比正常植株减少了的甲基化率比正常植株减少了0.50.52.52.5。而来自。而来自FGCFGC的变异植株，的变异植株，C C的甲基化率比正的甲基化率比正常植株减少了常植株减少了4.54.5 第四节 体细胞无性系变异的诱导与选择 l 体细胞无性系变异的挑选有以下一些明显的优点：体细胞无性系变异的挑选有以下一些明显的

55、优点：l 可以在小空间内对大量个体进展选择。可以在小空间内对大量个体进展选择。l 挑选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制。挑选可以在几个细胞周期内完成，且不受季节限制。l 由于实验在人工培育条件下进展，因此诱变和挑选条件由于实验在人工培育条件下进展，因此诱变和挑选条件可以根据需求进展调理和控制，从而提高了实验的反复可以根据需求进展调理和控制，从而提高了实验的反复性。性。l 由于变异是在单细胞程度上进展的，因此，一个突变体由于变异是在单细胞程度上进展的，因此，一个突变体就是来自一个细胞，不会有非突变细胞的干扰，防止了就是来自一个细胞，不会有非突变细胞的干扰，防止了整体植株程度上无性变异常呈

56、现出的嵌合体。整体植株程度上无性变异常呈现出的嵌合体。l 在细胞培育系统中，诱变剂可较均匀的接触细胞，因此在细胞培育系统中，诱变剂可较均匀的接触细胞，因此可以引起培育细胞相对较高频率的发生突变，添加了选可以引起培育细胞相对较高频率的发生突变，添加了选择时机。择时机。 l体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：l一种是一种是ChaleffChaleff提出的以提出的以R0R0、R1R1、R2R2、分别代分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代；表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代；l另一种是由另一种是由LarkinLarkin和和ScowcroftS

57、cowcroft提出的以提出的以SC1SC1、RC2RC2、RC3RC3、来分别代表体细胞无性系变异的当来分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代。代和自交以后的世代。 诱变资料的选择诱变资料的选择自发变异自发变异细胞诱变细胞诱变突变体挑选突变体挑选体细胞变异的运用体细胞变异的运用l 选择起始资料需思索以下几方面的问题选择起始资料需思索以下几方面的问题: :l 其一，目的性状的可行性。体细胞突变性状是个别的，其一，目的性状的可行性。体细胞突变性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物种类资料，经过诱变改动因此选择综合性状良好的植物种类资料，经过诱变改动个别不良性状是体细胞突变系选择的目的。

58、个别不良性状是体细胞突变系选择的目的。l 其二，必需充分思索实验植物的细胞培育技术程度。其二，必需充分思索实验植物的细胞培育技术程度。l 其三，适当的细胞类型亦是体细胞突变系挑选效率的重其三，适当的细胞类型亦是体细胞突变系挑选效率的重要条件。要条件。 如原生质体、单细胞、小孢子等有较高的诱如原生质体、单细胞、小孢子等有较高的诱变频率。变频率。一. 诱变起始资料的选择l离体培育再生植株的自发变异比自然条件下的变离体培育再生植株的自发变异比自然条件下的变异要高得多，普通可高出几百甚至上千倍。异要高得多，普通可高出几百甚至上千倍。l体细胞无性系自发变异频率既与培育物的遗传背体细胞无性系自发变异频率既

59、与培育物的遗传背景、外植体类型及培育类型有关，同时也受培育景、外植体类型及培育类型有关，同时也受培育时间、培育基成分等要素的影响。时间、培育基成分等要素的影响。l普通来讲，长期营养繁衍的植物、培育时间较长普通来讲，长期营养繁衍的植物、培育时间较长或继代次数多等，均容易出现较高的变异率。另或继代次数多等，均容易出现较高的变异率。另外，培育类型中，原生质体、细胞、愈伤组织培外，培育类型中，原生质体、细胞、愈伤组织培育等所出现的变异频率要高于组织或器官培育的育等所出现的变异频率要高于组织或器官培育的变异。变异。 l离体培育中体细胞自发突变产生的变异比较稳定，离体培育中体细胞自发突变产生的变异比较稳定

60、，没有人工诱变的后续干扰，有利于分别培育。没有人工诱变的后续干扰，有利于分别培育。二. 自发突变物物理理诱诱变变化化学学诱诱变变转转座座子子插插入入常用的射线处置包括：常用的射线处置包括：X X射线、射线、射线、快中子、紫外线射线、快中子、紫外线等。选择辐射类型应根据培育类型进展。等。选择辐射类型应根据培育类型进展。 以组织器官为诱导资料，可以选择辐射强度较大的以组织器官为诱导资料，可以选择辐射强度较大的射线、快中子等进展辐射。射线、快中子等进展辐射。 以细胞或原生质体，那么可以选择以细胞或原生质体，那么可以选择X X射线、紫外线等。射线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导资料时，可以运用紫外线