高效液相色谱质谱联用HPLC-MS试验含思考题

1、液相色谱-质谱联用技术（LC-MS的各种模式探索一、实验目的1、了解LC-MS的主要构造和基本原理；2、学习LC-MS的基本操作方法；3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。二、实验原理1 、液质基本原理及模式介绍液相色谱- 质谱法（ Liquid Chromatography/Mass Spectrometry ，LC-MS将应用范围极广的分离方法一一液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量 和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。但是，LC是液相分离技术，而 MS是在真空条件下工作的方法，因而难以 相互匹配。LC-MS经过了约 30年的发展，直至采用了大气压离子化

2、技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均 得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中， LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。（一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可 以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（ Q1 = 100-

3、259m/z）（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring， SIM）:不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物 的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例： （Q1 = 259m/z ）本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1:质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3: 质量分析器），由于多了 Q2、Q3 的存在，在分析测试的模式上又多了四种选 择：（三）子离子扫描模式（ Product Scan ）：第一个质量分析器固定扫描电 压，选择某一质量离子（母离子）进入碰撞室，发生碰撞解离产生碎片离子， 第二个质量分析器进行全

4、扫描，得到的所有碎片离子都是由选定的母离子产生 的子离子，没有 其它 的干 扰。 主要用于化合 物结 构分析。 实例：（ Q1 = 259m/z； Q3 = 100-259m/z ）（四）母离子扫描模式（ Precursor Scan ）：第一个质量分析器扫描电压 选择母离子（如分子离子） ，进入碰撞室碰裂后，第二个质量分析器固定扫描电 压，只选择某一特征离子质量，该特征离子是由所选择的母离子产生的，由此 得到所有能产生该子离子的母离子谱。主要用于同系物的分析。实例：（Q1 =100-300m/z；Q3 = 259m/z ）（五）中性丢失扫描模式（ Neutral Loss ）：第一个质量分析

5、器扫描所有 离子，所有离子进入碰撞室碎裂后，第二个质量分析器以与第一个质量分析器 相差固定质量联动扫描，检测丢失该固定质量中性碎片（如质量数15、 18、45）的离子对，得到中性碎片谱。主要用于中性碎片的分析。实例：（Q1 =100-300m/z ；Q3 = 82-282m/z ）（六）多反应监测模式（MR）第一个质量分析器选择一个（或多个）特 征离子，经过碰撞解离，到达第二个质量分析器再进行选择离子检测，只有符 合特定条件的离子才能被检测到，因为是两次选择，比单四极质量分析器的 SIM 方式选择性、排除干扰能力、专属性更强，信噪比更高。主要用于定量分 析。实例： （Q1 = 259m/z ；

6、Q3 = 138m/z ）2、实验内容简介邻苯二甲酸酯（简称PAEs是一类重要的环境内分泌干扰物，常被用作塑料 的增塑剂，也可用作农药载体。近年来，随着工业生产和塑料制品的广泛使 用，邻苯二甲酸酯不断进入环境，普遍存在于土壤、底泥、大气、水体和生物 体等环境样品中，成为环境中无所不在的污染物。据报道，邻苯二甲酸酯类具 有较弱的环境雌激素成分，具有影响生物体内分泌和导致癌细胞增殖的作用。 环境内分泌干扰物是指能改变机体内分泌功能，并对机体、后代或（亚）种群 产生有害效应的环境物质。由于环境内分泌干扰物对人和动物有种种不良影响，对环境内分泌干扰物的研究已成为国际关注的焦点。我国也正在逐渐重视 有关

7、环境内分泌干扰物的研究。三、仪器与试剂1、仪器液相系统： Varian Pro Star ；自动进样器： Varian 410 自动进样器；质谱仪： Varian 310 LC-MS/MS 三重四极杆质谱仪( ESI 离子源)；色谱柱：Varian Inertsil 3 ODS-3(150mM 2mn, 3 卩 m)。2、试剂甲醇：HPLC色谱纯；超纯水： Millipore Express 超纯水系统制备；标准溶液：用甲醇配制邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)混合标准溶液(O.lppm)。四、实验步骤1 、条件设置色谱条件：流动相(90%甲醇

8、+10%水)；流速( 0.2ml/min )；扫描时间( 7min)；离子源模式：电喷雾电离(ESI),正离子模式；扫描条 件： Detector ： 1000V； Needle ： 5000V； Shield ： 600V； Spray Chamber Temperature : 50 °C； Nebuliz ing Gas Pressure : 55psi ； Drying Gas Pressure : 18psi , Drying Gas Temperature ( C): 250C, Capilary Voltage 30(V) ， Coll.Energy 30(v)；质量分

9、析器：三重四极杆；进样体积： 10ul 。2、实验测定按实验操作规程完成仪器开机、参数设置及测定。根据表1中的数据，设置 m/z,选择各种扫描模式(全扫描、选择离子扫描、子离子扫描、母离子扫描、多反应监测模式)进行测定。3、数据处理表1待测物质的母离子和主要子离子DMPDEPDBP母离子195.1223.1279.1（m/z）子离子163.1149.1149.1（m/z）（一）全扫描模式方式（Scan）:*1 丨歿R % (X I 四+函”忑闽(二)选择离子监测模式(Selective Ion Monitoring, SIM):224Acquirsd Range m/zMCounl&1

10、.5-1 0-0 6-S/N (RMS): 1484S-2.11e+QQ6N- 14243-46-4Q PM-9-20-2aW-3ampls1Filtered 世凶501DQ1- n也.mutes| | j1 | OFFHp F sIons：-1剣幻|夷*环F X II *1血闽2(刃 mim Sc汕；11匕 223,0： RIC; 2刃加圧唧理纳1Spectrum 1A日P 223.1 (2,37矢也=100%),pm9：282J1®wampl1MCcunlS2231 237佔1A2.(P0(H(三)子离子扫描模式(Product Scan ):*1 1|歿， ” X览彳rH回匝闽

11、(四)母离子扫描模式(Precursor Scan ):1 I off*1pJ J- sIons：=1时1畫 ” IT i1 rr T直庇帆1Spectrum 1ABP:CB38D40hClCl%)" 4-13囚kCounts：2.074 min, Scan: 11E, 100.0:350.0>149.0 -15.0V1. RIC: 2.714e+6 ZS.3330401A3001 1350100200250300223.0>ld.J（五）多反应监测模式（MR）-15.0V/n fRMSj： 1911S; 964393N: 5050.7&H0 25-ow50

12、9;'''JJJ"10.012.615.017.5111 I 0FF*|p| 1 sIons：N 3 HHE | TT *個*蓝闽MCounts;Segment 11490104卩柘Spectrum 1AEF1: MPO 化一04沧託hClO临），422-羽少m-9-2手201®騎mpl/.xms 2IK3 min,氐art 杓，223.CMA9U 戸5.0£, R£: LO4兀代minutes0.7&I1Aosoe0 0（H14914915f4、思考题1、各扫描模式中m/z分别如何设定?（一）全扫描模式方式（Scan）：

13、 100-300m/z;（二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring ，SIM）: 279m/z;（三）子离子扫描模式（Product Scan ）: Q1=279m/z,Q2=100-279m/z;（四） 母离子扫描模式（Precursor Scan ）: Q仁 149-300m/z ,Q2=149m/z;五）多反应监测模式（ MRM）： Q1=279m/z,Q2=149m/z;2、比较各模式的测定结果，讨论各模式在测定中的作用。（一）全扫描模式方式（ Scan）： 扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是 化合物的全谱，一般用于未知化合物的定性分析。（二）选择离子监测模式（ Selective Ion Monitoring， SIM）：跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目 标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。（三）子离子扫描模式（ Product Scan ）： 对碰撞解离产生碎片离子，第二个质量分析器进行全扫描，得到的所有碎 片离子都是由选定的母离子产生的子离子，没有其它的干扰。主要用于化合物 结构分析。（四）母离子扫描模式（ Precursor Scan ）： 第一个质量分析器根据某一特征离子质量扫描电压，确定该特征离子是由 哪种所选择的母离子产生的