ykl40作为肿瘤标志物对肝细胞癌的诊断价值

1、分类号vdcmu密级硕士学位论文ykl-40作为肿瘤标志物对肝细胞癌的iia.诊断价值ykl-40 expression in humanhepatocellular carcinoma:a potentialbiomarker?作者姓名：李群芳答辩委员会主学科专业：传染病学 学院（系、所）：湘雅二医院 导师：陈军副教授论文答辩日期中南大学二o一年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。

2、与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：日期：洌年上月习日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文, 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库, 并通过网络向社会公众提供信息服务。制年r月习日女q四ykl-40作为肿瘤标志物对肝细胞癌的诊断价值摘要背景与目的：ykl4）是一种新发现在多种恶性肿瘤中具有诊 断价值的肿瘤标志物。肝细

3、胞癌在我国高发恶性肿瘤之一，要早期诊 断肝癌，需要有高灵敏度及特异度的诊断指标。ykl40能否作为诊 断肝细胞癌新的肿瘤标志物仍不明确。本研究的目的是检测ykl40 在肝细胞癌患者血清、肝癌组织中，以及在肝癌细胞株中的表达，从 而评价ykl40作为肿瘤标志物对肝细胞癌的诊断价值。方法：选取2006年在美国加州大学hillcrest医院经外科肝癌切 除术的8名肝细胞癌患者，免疫组织化学染色检测ykl40在肝癌组 织及癌旁肝组织中的表达；收集2007年至2009年在湘雅二医院诊疗 的30例肝细胞癌患者、30例肝硬化患者及30例肝功能正常的乙型 肝炎病毒携带者，酶联免疫吸附试验检测各患者血清ykl4

4、0浓度； 应用rt-pcr检测三种不同肝癌细胞株及两种正常肝细胞株中 ykl-40 mrna 的表达。结果：u免疫组织化学染色显示，肝细胞癌患者肝癌组织中ykl/0 表达明显高于癌旁肝组织。2、酶联免疫吸附检测显示，与乙型肝炎病毒携带者相比，肝细 胞癌组与肝硬化组患者血清ykl40浓度均明显增高；但是肝细胞癌 组与肝硕化组间的ykl-40水平无显著差异。3、rt-pcr检测显示，三种肝癌细胞株（hepg2、huh7、lm-3）中的ykl-40 mrna水平表达明显高于两种正常肝细胞株 （qsg力01、lx-2 ）o结论：ykl40在肝细胞癌分子、细胞及组织水平均高度表达。但是，肝细胞癌患者与肝

5、硬化患者血清ykl40水平无明显差别，因 此，ykl/0作为一种新的肿瘤标志物在肝细胞癌诊断中尚无明确诊 断价值。关键词：人类软骨糖蛋白39 （ykl4）；肝细胞癌；肝硬化ykl-40 expression in human hepatocellular carcinoma:apotential biomarker?abstractbackground: ykl-40 is a new biomarker with a diagnostic value in many different cancers. whether it may serve as a biomarker for hepa

6、tocellular carcinoma (hcc) is still unclear to examine the expression of ykl-40 in the serum and liver tissues of hepatocellular carcinoma (hcc) patients and in hcc cell lines, in comparison with that in non-hcc liver disease patients and non-tumor hepatic cell lines, respectively.methods: immunohis

7、tochemical staining was used to detect j. ykl-40 protein expression in liver biopsy specimens from 8 hcc patients. elisa was used to detect the serum ykl-40 level in 30 hcc patients, 30 inactive hbsag carrier (ihc) patients with normal liver functions, and 30 liver cinhosis patients. rt-pcr was empl

8、oyed to examine ykl-40 mrna expression in three hcc cell lines and two non-tumor hepatic cell linesresults:immunohistochemcal staining of liver biopsy specimens from hcc patients showed that ykl-40 protein expression in tumor tissue was higher than that in adjacent normal tissues. elisa revealed tha

9、t the ykl-40 serum level in the hcc group was significantly higherinthan that in the ihc group (p<0.01), but without significant difference from that in the cirrhosis group (p>0.05). rt-pcr showed that ykl40 mrna levels in hcc cell lines were significantly higher than those in non-tumor hepati

10、c cells (p<0.01).conclusion: ykl-40 is highly expressed in hcc at the molecular, cellular and tissue levels. however, it may not serve as a serum biomarker for hcc because detection of the serum ykl-40 level can not distinguish hcc from cirrhosis.keywords: ykl-40; hepatocellular carcinoma; cirrho

11、sis目录摘要iabstractill缩略词vi第一章前言1f第二章材料与方法32.1主要试剂32.2主要仪器 42.3主要溶液配制.52.4研究对象62.5免疫组织化学实验62.6酶联免疫吸附试验82.7 rt-pcr92.8统计学方法12第三章结果133.1肝癌组织及癌旁肝组织ykl40的表达 133.2三种不同肝病患者血清ykl40浓度143.3不同肝癌及肝细胞株ykl40mrna的表达16第四章讨论18第五章结论21参考文献22附录25综述26致谢36一缩略词abbreviations缩略词英文全称中文全称afpa-fetoprotein甲胎蛋白albalbumin白蛋白altalan

12、ine aminotransferase谷丙转氨酶bpbase pair碱基对cdnacomplementary deoxyribonucleic acid互补脱氧核糖核酸ctcomputed tomography电子计算机x射线断层 扫描技术depcdiethyl pyrocarbonate二乙基焦磷酰胺dmemdulbecco*s modified eagle's medium达尔伯克（氏）改良伊格 尔（氏）培养基dntpdeoxy-ribonucleoside triphosphate三磷酸脱氧核糖核昔dnadeoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸dsadigita

13、l subtraction angiography数字减影血管造彩edtaethylenediamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸fbsfetal biovine serum胎牛血清gapdhglyceraldehyde phosphate dehydrogenase磷酸甘油醛脱氢酶gloglobulin球蛋白hahyaluronic acid透明质酸hbvhepatitis b virus乙型肝炎病毒hcchepatocellular carcinoma肝细胞癌lnlaminin层粘连蛋白m-mlvmoloney murine leukemia virus reverse

14、 transcriptase莫洛尼鼠白血病反转录 酶mrimagnetic resonance imaging核磁共振成像mrnamessenger rna(ribonucleic acid)信使rna0doptical densiny光密度pbsphosphate buffered saline磷酸盐缓冲液pcrpolymerase chain reaction聚合酶链式反应rpmrevolutions per minute每分钟转数rtreverse transcription逆转录rnaribonucleic acid核糖核酸rnaseribonuclease核糖核酸酶rnasinrib

15、onuclease inhibitor核糖核酸酶抑制剂rt-pcrreverse transcription polymerase reactionchain逆转录聚合酶链反应tbetris/borate electrophoresis buffertris/硼酸电泳缓冲液tristris(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷ykl-40human cartilage gp-39人软骨糖蛋白39ykl-40作为肿瘤标志物对肝细胞癌的诊断价值第一章前言肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, hcc）是临床上常见的恶性肿瘤之一，在 全球其发病率

16、居第六位，死亡率居第三位，每年约60万人死于原发性肝癌，在肿 瘤相关死亡中仅次于肺癌及胃癌。其中大多数病例以发展中国家为主，尤其以我 国、东南亚和非洲国家的发病率最高，在我国，肝癌发病人数约占全球的55%。 早期确诊肝细胞癌并对患者进行有效的临床治疗能明显延长患者生存期囚。由于 hcc早期临床症状及体征不明显，大多数患者就诊时肿瘤已进展至中晚期，故肝 癌治疗效果及预后差，死亡率高。因此，早期发现、早期诊断、早期治疗是提高 肝细胞癌患者治疗疗效、降低肝癌死亡率、延长患者生存期的关键。hcc的诊断标准包括病理学诊断标准和临床诊断标准。诊断方法包括血清 肿瘤标志物甲胎蛋白（afp）检测、肝脏影像学检

17、査（包括超声显像、ct、mri 和dsa血管造影等）以及病理组织学检査（主要是肝组织活检）。而肿瘤标 志物检测相较于彩像学检查来说，其费用低：相较于病理活检來说无创伤，患者 更易于接受，便于推广。因此肿瘤标志物可广泛应用于癌症的筛査、早期诊断、 疗效检测，预后判断等。长期以来，肿瘤标志物检测是用于hcc筛査及诊断中 最有效的方法之一，其中甲胎蛋白（afp）是迄今为止发现最早而又应用最广的 肝癌肿瘤标志物。大多数临床研究结果表明，甲胎蛋白（afp）在诊断hcc的 敏感度为41%-65%,特异度为80%-94%（4,#尽管afp作为筛査及诊断hcc主 要的肿瘤标志物，但是最近有文献报道分析显示了

18、afp在筛査和诊断hcc的局 限性。在80%小肝癌中afp值并不升高,研究表明当肝癌肿瘤组织直径大于3cm 时，afp的敏感度为52%,肿瘤直径小于3cm是，敏感度降至25%,其诊断敏 感度和特异性也存在不足。afp在肝癌的早期诊断中仍有40%的假阴性率，因 此造成了临床上肝癌的漏诊。目前，除了甲胎蛋白（afp）作为肝癌筛査及诊断的肿瘤标志物，在临床上 用于hcc诊断的肿瘤标志物主要有：afp异构体（afpl3）、al岩藻糖甘 （afu）、厂谷氨酰转肽酶（y-gt）及其同工酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 （gpc3）、去厂竣基凝血素（dcp）等。但它们均为非器官特异性的肿瘤标志物，其敏感 性及特异性

19、不高。因此，需要发现其他敏感性髙及特异度好的肝癌相关肿瘤标志 物，为确诊肝癌提供重要的辅助诊断依据。ykl40是一种新发现在多种恶性肿瘤中具有诊断价值的肿瘤标志物。ykl40是一种肝素和几丁质结合糖蛋白，又称人类软骨糖蛋白39叫是哺乳动物18糖基水解酶家族成员之一.基于该蛋白的肽链氨基端起始三个氨基酸为酪（y）、赖氨酸（k）和亮氨酸（l）,以及它的相对分子量为40kda,故命名为ykl-4019人类ykldo基因位于1号染色体q31-q32±,包含了 10个外 显子和跨越了 8kb的基因组dnap0jo根据美国国家生物技术信息中心的表达序列标记数据库的数据，在对ykl40蛋白的研究中

20、，发现许多不同类型的实体肿瘤均表达ykl4）,如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌.胰腺癌.结肠癌、10志甲状腺癌，骨肉瘤，神经胶质瘤、肾癌、前列腺癌、以及生殖细胞肿瘤患者血清 中浓度明显增高，同时，血清高浓度ykl40的患者总体生存期短、预后差】。 目前研究证明，它是一种在多种恶性肿瘤中高度表达及分泌的蛋白，在肿瘤细胞 的增殖、分化及肿瘤周围炎症及血管发生、细胞外基质重塑等方面发挥着重要作 用。在本研究中，拟对肝细胞癌患者术前血清ykl40进行检测，并研究肝癌组 织中ykl4）的表达以及yklmomrna在肝癌细胞株中的表达，从而研究 ykl40作为一种新的肿瘤标志物在肝细胞癌中的诊断价值。第

21、二章2.1主要试剂材料与方法主要试剂来源ykl-40 elisa kit美国metre生物公司dmem细胞培养液美国gibico/brl公司胎牛血清(fbs)美国gibco公司胰蛋白酶美国sigma公司鼠抗人ykl-40抗体美国加州大学生物系professor, phd paul a惠赠抗生物素标记羊抗鼠igg丹麦 dakocytomation 公司depc(焦碳酸二乙酯)北京鼎国生物科技有限公司trizol© reagent美国invitrogen公司m-mlv逆转录酶美国promega公司dna多聚酶美国promega公司dntps美国promega公司琼脂糖粉上海基因技术公司e

22、dta北京鼎国生物科技有限公司硼酸北京鼎国生物科技有限公司氯仿、异丙醇、无水乙醇湖南师大试剂厂tritonx100北京鼎国生物科技有限公司trisbase北京鼎国生物科技有限公司漠乙锭华美生物工程公司dab染色试剂盒北京中杉金桥公司revert aid first strand cdnasynthesis kit美国fermentas公司2xpcr master mix美国fermentas公司dna marker： 1 oobp dna ladder上海天根公司硕士学位论文第一章材料与方法2.2主要仪器主要仪器来源ronshen 冰箱广东海信公司bio-rad基准酶标仪美国bio-rad公司

23、石蜡切片机德国leica公司tg16-ws台式离心机湘仪公司tdl-16台式高速冷冻离心机长沙平凡仪器恒温c02培养箱德国former公司超净工作台、江苏安泰公司倒置光学显微镜日本olympus公司fr-2000成像分析系统上海复日公司电泳装置美国bio-rad公司ay120电子天平日本岛津公司ptc-100pcr 扩增仪美国 mj research.inc 公司bds160电热恒温三用水箱北京医疗器械厂t6新世纪紫外分光光度计北京普析通用仪器公司xw-80a旋涡混合器上海精科实业公司恒温振荡器国华企业电热干燥箱长沙仪器仪表厂2.3主要溶液配制（1）磷酸盐缓冲生理盐水（pbs）kcl0.2gk

24、h2po40.24gnacl&0gna2hpo412h2o3.63g加蒸憾水至1000ml（2 ） 200inmovl谷氨酰胺液谷氨酰胺2.922g三蒸水100ml过滤除菌，分装后20c保存备用<4） 0.25%胰蛋白酶-0.03%edta溶液胰蛋白酶（1： 250）250mgedta 4na30mg平衡盐溶液（无ca2+、mg2*）100mlnahcch或hci调节ph至7.2,过滤除菌，分装后代储存（5）6x凝胶加样缓冲液二甲苯青ff0.25%溟酚蓝0.25%甘油水溶液30%（6）5xtbe电泳缓冲液tris54g硼酸27.5g0.5mol/l edta20ml加蒸馆水至10

25、00ml2.4研究对象1组织标本选取2006年在美国加州大学hillcrest医院行外科肝癌切除术的8名肝细胞 癌患者肝癌组织标本（术前患者均未行放疗化疗或生物治疗，经病理学检査明确 为原发性肝细胞癌患者）；同时，选取接受手术治疗肝癌患者的癌旁肝组织标本 作为对照组.2血清标本收集2007年至2009年在中南大学湘雅二医院就诊经临床和病理确诊为肝细 胞癌患者3附（未行放疗或化疗治疗），肝硬化患者30例，非祜创厭型肝炎病 毒携带者30例，所选患者均除外骨关节病及其他肿瘤病史。所有肝细咆癌患者均 经过外科手术切除病理切片确诊，肝硬化患者及慢性乙型肝炎患者经卄活检行病 理诊断确诊。肝癌患者于术前收取

26、静脉血液标本，肝硬化患者及非活动期乙型肝炎病毒携 带者于肝活检前收取标本。所有静脉血液标本采用非抗凝管收集抽取静脉血，室 温下自然凝固，4000rpm离心5min,吸取上层血清，将血清移至1.5mlep管中， 做好标记，4小时内放入冰箱20° c冻存，所有血清标本避免溶血和及复冻融。3细胞标本qsg7701细胞株：为正常肝脏上皮细胞株，由湖南国狮基因生物科技公司 惠赠。lx2细胞株：为肝星状细胞株，购于中南大学湘雅细胞中心。hepg2细胞株：为肝癌细胞株，购于中南大学湘雅细胞中心。huh7细胞株：为肝癌细胞株，购于中南大学湘雅细胞中心。lm3细胞株：为肝癌细胞株，购于中南大学湘雅细胞

27、中心。2.5免疫组织化学实验1组织常规脱蜡.水化步骤（1）组织脱水：按 70%-80%-85%-90%-95%.100%-100%度酒楙脱水，各 15分钟。(2) 组织透明：二甲苯浸泡10分钟，共两次。(3) 组织浸蜡：浸泡2小时。(4) 组织包埋。(5) 蜡块冰冻后切片。(6) 烘烤：60。(?恒温箱放置2小时。(7) 脱蜡、水化:二甲苯浸泡15分钟，各2次;按梯度酒精100%100%95%> 95%-85%-80%-70%-水浸泡水化，各2分钟。2免疫组化染色步骤(1) 组织切片常规脱蜡、水化。(2) pbs洗涤3次，每次3分钟。(3) 3%h2o2滴加在组织上，室温孵育10分钟。(

28、4) pbs洗涤3次，每次3分钟。(5) 抗原修复：加枸椽酸钠换缓冲液(ph6.0)浸泡组织，微波加热至沸腾, 煮沸后冷却5分钟，再次煮沸后冷却至室温。(6) pbs洗涤3次，每次3分钟。(7) 滴加蛋白阻断工作液a液(正常山羊血清封闭液)，室温孵育5分钟, 甩去多余阻断液。(8) 滴加生物素化1抗工作液50ul,室温孵育1小时。(9) pbs洗涤3次，每次3分钟。(10) 滴加生物素化2抗工作液b液50ul,室温孵育10分钟。(11) pbs洗涤3次，每次3分钟。(12) 滴加溶液3 (辣根过氧化酶标记的链霉卵白素工作液)，室温孵育10 分钟。(13) pbs洗涤3次，每次3分钟。(14)

29、dab染色510分钟，显微镜下观察掌握染色程度。(15) pbs冲洗10分钟。(16) 苏木精复染10分钟。(17) pbs 冲洗。（18）干燥、封片、镜检、拍片。质量控制：设立阳性对照和阴性对照，以pbs代替一抗作为阴性对照。结果判定：ykl40蛋白免疫组化阳性反应表现为胞质棕色颗粒状物质， ykl40的表达水平判断基于染色阳性细胞百分比。每片观察5个40h0倍的视野, 每个视野计数阳性细胞的百分数，取其平均值。0分：阳性细胞百分比5%以下； 1分：阳性细胞百分tt5%-25%； 2分：阳性细胞百分比25%-50%； 3分：阳性细胞 百分tt5o%-75%； 4分：阳性细胞百分比75%及以上

30、.2.6酶联免疫吸附试验（1）实验前20分钟从冰箱取出试剂盒及待测血清样本，平衡至室温。（2）建立标准曲线：设标准管8孔，每孔中各加入样品稀释液100u1,第一 孔加标本品looul,混匀后用加样器吸出looul,移至第二孔。如此反复对倍稀释 至第七孔，最后，从第七管中吸出looul弃去，使之体积均为100ulo第八孔为空 白对照。（3）加样：待测品孔中每孔各加入待测样品looul.（4）将反应板置37。（： 120分钟。（5）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤6次，向滤纸上印干。（6）每孔中加入第一抗体工作液50ul。（7）将反应板充分混匀后置37°c 60分钟。（8）洗板：用洗涤液将

31、反应板充分洗涤6次，向滤纸上印干。（9）每孔中加入酶标抗体工作液looul。（10）将反应板置37°c 120分钟。（11）洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤6次，向滤纸上印干。（12）每孔中加入底物工作液looul,置37。（：暗处10分钟。（13）每孔加入50ul终止液混匀。（14）在450nm处测吸光值。以标准品浓度为横坐标，od值为纵坐标，将不同稀释浓度标准品od值减空 白对照od值绘制成曲线，平滑曲线连接各标准品的坐标点。以标本od值减空白对照0d值，所得值在标准曲线上得出相应ykl40浓度。2.7 rt-pcr1细胞培养三种肝癌细胞株及两种正常肝细胞株分别在10%胎牛血清的d

32、mem培养液 中于5%co2、37°c培养箱培养，待细胞生长铺满培养皿底后，0.25%胰蛋白酶 消化传代种植于六孔培养板中，72小时后待细胞达8090%融合时收集细胞。2细胞rna的提取采用trizol® reagent提取细胞总rna的方法具体如下：(1) 所有用品均经0.1%depc水处理并高压蒸汽灭菌(包括eppendorf管/ep 管，tip头等)，所有操作均在无菌操作台进行。(2) 在每一个培养孔中加lmltrizol® reagent,用tip头吹打，将底部的细胞均溶解在溶液中，再将溶液移入1.5mlep管中，室温静置5分钟。(3) 加入0.2ml氯仿

33、，上下振荡15秒混匀，冰置5分钟。(4) 12000rmp 4°c 离心 15 分钟。 收上清于1.5mlep管，加等量异丙醇振荡混匀，室温静置10分钟。(6) 12000rmp4°c离心10分钟，弃上清，留下rna沉淀。(7)加70%的乙lml,颠倒混匀，7500rmp 4°c离心5分钟。(8) 弃乙醇，室温空气中晾干1015分钟，至微量乙醇挥发干净，加入20u1depc处理的灭菌去离子水溶解rna,3 rna的测定紫外分光度计扫描测定rna浓度和纯度：吸取5ulrna的样品加depc处 理的灭菌去离子水2.95ml稀释至3ml,以3ml稀释用水效正分光光度计的

34、零点, 在260nm及280nm两个波长下读数，在260nm的读数用于记数样品中的核酸浓 度，根据od260/od280的值估计核酸的纯度。样品rna浓度(g/ml)计算公式 为:a260 x稀释倍数x40 g/ml, rna纯样品的od260/od280值分别为2.0。如 果样品中有蛋白质或酚污染，其od260/280将明显低于此值，此时无法对样品 中的核酸进行精确定量。4引物(1) ykl40引物：ykl-40 正向引物：5' ggatggaactttgggtctca 丁。ykl-40反向引物：5gctgtttgtctctccgtcca3,引物自身不含互 补或发夹结构，扩增片段长度

35、为175bpo(2) gapdh 引物：gapdh 正向引物:5' ccacccatggcaaattccatg-3gapdh 反向引物:5，tctagacggcaggtcaggtccacc丁，扩增片段 长度为598bp°引物设计后，由上海生工生物工程技术服务有限公司dna合成部合成，合 成后的引物用灭菌去离子水配成10umol/l浓度。5 rt-pcr按照revert aid first strand cdna synthesis kit说明书进行。先在逆转录酶 的作用下，用已提取的mrna为模板合成互补的cdna,再以此cdna为模板 进行pcr反应，获取双链dna。rtp

36、cr中的关键步骤是rna的逆转录，要求 rna模板必须是完整的，且不含dna、蛋白质等杂质。(1) cdna链的合成：在反应体系中依次加入：depc处理水9uloligo(dt)15primer(0.5ug/ul)2ul样品rna4ul15ul混匀，瞬时离心后7(tc加热5分钟,立即置冰上冷却，再依次加入depc处理水0.5ul5><m-mlv reverse transcription buffer5uldntpmix(lomm)2.5ulribolock rnasin inhibitorlulm-mlv reverse transcriptaselul10ultotal vol

37、ume25ul混匀，瞬时离心后42c30分钟，99*c5分钟灭活逆转录酶，冰上放置5分钟。(2) pcr扩增在中号ep管中依次加入下列成分ddh2olul2xpcr master mix12.5ulprimer( 1 oumol/l)2ulprimer(10umol/l)2ulfirst strand cdna7.5ul25ultotal volumepcr反应条件:94*c3分钟94r30 秒，60*c 30 秒，72*c30 秒共 35cycles72 *c7分钟35cycles94x? f 94cf 60°cf 72*c 72cf 4*c 3min 30sec 30sec 30

38、sec 7min(3) ykl40 mrna pcr 产物鉴定取ykl-40 mrna pcr产物5ul,在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增结果， 以内对照gapdh引物扩增的pcr (反应条件同前)作为内对照，并用dna分 子量标准检査特异性扩增条带大小。2.8统计学方法采用spss13.0软件进行分析，采用单因素方差分析及完全随机多个独立样 本kruskal-wallis h检验比较分析肝细胞癌组、肝硬化组与乙型肝炎病毒携带组 间血清ykl-40浓度，采用roc曲线来评价ykj40对肝细胞癌中的诊断价值。 p<0.05为有统计学意义。第三章结果3.1肝癌患者肝癌组织及癌旁肝组织ykl40

39、的表达ykl40免疫组织化学染色阳性表现为胞质棕色颗粒状物质（见图1）。肝细 胞癌患者肝癌切除术后，免疫组织化学染色显示8例肝癌患者肝癌组织ykl40表达明显高于癌旁肝组织（p<0.01）ob图1肝癌组织及癌旁组织ykl40免疫组织化学染色a： ykl40阳性免疫染色呈现出胞质棕色颗粒状物质；b：无染色肝细胞。表1显示，在8例肝癌患者肝脏组织中，大部分肝癌组织阳性细胞与所有细胞 比值大于50% （7/8, 87.5%）,而所有癌旁肝组织的阳性细胞比值低于50%（8/8, 100%）；另一方面，肝癌组织的阳性细胞总分值为28分，显著高于对照组癌旁肝 组织总分值为7分（pv0.01）。表1肝

40、癌组织及癌旁组织ykl-40免疫组织化学染色分析组别ykl-40阳性细胞分值总分值*01234肝癌组织1 2528癌旁组织25170分（阳性细胞百分比5%以下）、1分（阳性细胞百分比5%-25%） . 2分（阳性细胞百分比25%-50%）、3分（阳性细胞百分比50%-75%）. 4分（阳性细胞百分比75%及以上）；总分值 为所有患者阳性细胞百分比所占分值总和，相比于癌旁肝组织，肝癌组织的总分值有明显差异(p<0.01) 3.2研究对象一般情况及生化参数表2显示了肝细胞癌组、肝硬化组、非活动期乙型肝炎病毒携带组三组间的 年龄差异及性别特征无统计学意义（px）.o5）:肝硬化组患者肝纤四项比

41、肝细胞 癌组及非活动期乙型肝炎病毒携带组明显增高（pv0.05）；而肝细胞癌组患者甲 胎蛋白明显高于肝硬化组和非活动期乙型肝炎病毒携带组患者（pv0.05） o表2三种不同肝病患者的一般情况及生化特征生化待征肝细胞癌组非活动期乙型肝炎病莓携带组肝硬化组病例数303030年龄（岁）45.81±18.0943.90±21.4539.8h19.56性别（男性）272828alt(u/l)215.84±125.7028.7h16.58*189.34±34.89glo(gzl)34.8u21.8025.73±19.14*35.25h7.66alb(g/l

42、)38.95±15.1139.91±21.9930.h17.4phinp(pg/l)15.6q±8.4314.74±2.3225.0w07"ha(>ig/l)187.1±s&06715±43.7137639±23112"ivco!(gg/l)184.7±76.6988.h45.0828709±16545"ln（嶼）189.4±75.8167.1 ±34.593%21±176血"afp(ng/ml)57809±32

43、113"21.55±18.4156.75±34.24virological markerhbvhbvhbvalt：谷丙转氨酶；glo：球蛋白；alb：白蛋白：pfflnp： iii型前胶原肽：ha：透明质 酸；ivcol : iv型胶原质；ln：层粘连蛋白：hbv：乙型肝炎病毒：afp：甲胎蛋白： virological marker :病毒学标志；p<0.05有统计学意义（粗体显示）；与肝细胞癌组或肝 硬化组相比,pv0.05；"与非活动期乙型肝炎病毒携带组或肝细胞癌组相比p<0.05；与非活动期乙型肝炎病毒携带组或肝硬化组相比p<0

44、.05>表3显示了三种不同肝病患者血清中的ykl-40浓度，肝硬化患者及肝细胞癌患者血清的ykl40浓度明显高于非活动期乙型肝炎病毒携带患者血清的ykl40浓（p<0.01）；然而肝硬化患者与肝细胞癌患者两组间血清ykl40浓度没走有差异（px）05）。我们定义血清ykl40浓度大于100ng/ml为高ykl4o水平患者，40肝硬化患者及肝细胞癌患者高ykl40水平患者百分比明显高于对照组非活动期乙型肝炎病毒携带患者（p<0.01）。表3 三种不同肝病患者血清ykl-40浓度组别病例数ykl40浓度(ng/ml)高ykl-40水平患者百分比非活动期乙型肝炎病毒携带者3061.

45、35±46686(20%)肝硬化30196.4i47.61 28(93%广肝细胞癌30193.86±48.76 28(93% 尸肝硬化患者及肝细胞癌患者血清ykl40浓度和高ykl40患者百分比，与慢性乙型肝炎 患者相比，有显著性差异（p<0.01）；但是肝细胞癌患者与肝硬化患者相比，两者之间的血清 ykl-40浓度和高yki.-40患者百分比无显著性差异（px）.o5）。roc曲线分析结果显示，肝癌组（a）、肝硬化组（b）及非活动期乙型肝 炎病毒携带者（c）组roc曲线下面积（auroc）分别为0.716、0.742及0.046 （见图2）,所得的结果有统计学意义（

46、p<0.001）o不同肝病患者血清ykl40浓 度的roc曲线下面积（auroc）、敏感度及特异度（见表4）。图2 roc曲统分析ykl40诊斷价值肝癌组血清ykl40浓度roc曲线下面积为0.716；肝硬化组roc曲线下面积为0.742；乙型肝炎病毒携带者组roc曲线下面积为0.046,乙型肝炎携带组曲 线下面积相较于肝癌组及肝硬化组明显偏小。roc曲线下面积分析ykl-40对肝 细胞癌及肝硬化具有一定的诊断价值，但对乙型肝炎病毒携带者不具有诊断意 义。表4不同患者roc曲线下面积、灵敏度及特异度组别auroc灵敏度（）特异度（）肝细胞癌0.71689.753.3肝硬化0.742833

47、61非活动期乙型肝炎病毒携带者0.954»933拿89.8*曲线f面积越小，其排除诊断亦有意义。3.3不同肝癌及肝细胞株ykl-40 mrna的表达k:状lrt-pcr检测三种肝癌细胞株hepg2> huh-7. lm-3及人正常肝细胞株qsg-770l人肝星状细胞株lx2中ykl-10mrna的表达。结果如图3,正常肝 细胞株qsg-7701.肝星状细胞株lx2几乎没有ykl-40 mrna表达：而肝癌细胞株hepg2、lm3、h讪7均有ykl-40 mrna表达。1、人正常肝细胞株qsg-77012、人肝星状细胞株lx23、肝细胞癌细胞株hepg2gapdhykl-404、

48、肝细胞癌细胞株lm35、肝细胞癌细胞株huh7内参gapdh表5显示了qsg-7701细胞、lx2细胞、hepg2细胞、lm3细胞、huh7细胞 中ykl40的灰度值，使用gapdh作为对照参数，肝癌细胞株中的ykl40灰度 值均在60以上，而正常肝细胞株中的ykl40灰度值在6以下。表5各细胞株ykl-40 mrna水平灰度值及指数qsg-7701lx-2hepg2lm3hun-7ykl-4097.9693.39142.25102.66176.66gapdh215.19201.62149.14109.19207.74指数5.782.3688.2064.5573.43ykl-40mrna 灰度

49、值指数二（ykl-4o-背景）xioo/（gapdh背景）。正常肝细胞株：qsg-7701. lx-2；肝细胞癌细胞株：hepg2、huh-7 . lm-3.第四章讨论肝细胞癌(hcc)发病率在男性中位列第五位，女性中在第八位，hcc的发 病率和病死率基本相当，五年生存率在3%>5%.hcc患者的存活率很低，在 临床上，大部分患者就诊时已是肿瘤晚期，已失去治疗的最佳时机，因此早期诊 断就显得尤为重要。目前临床上主要运用甲胎蛋白(afp)结合彩像学及病理学 检査进行肝癌的早期诊断，但是afp对于肝癌筛査的敏感度及特异性均不十分理 想。在我国hcc的诊断包括病理学诊断标准和临床诊断标准。肝癌

50、的临床诊断标 准包括：af400ug/l,能排除妊娠.生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移 性肝癌，ct/mri检査有肝癌特征的占位性病变者；afpv400ag/l能排除妊娠、 生殖系胚胎源性肿瘤、活动性肝病及转移性肝癌，并有两种影像学检査有肝癌特 征的占位性病变或有病理确诊的肝外转移病灶(包括肉眼可见的血性腹水或在其 中发现癌细胞)。肿瘤标记物是癌细胞生长过程中产生的一种或几种正常情况下没有的或含 量很低的特异性物质，或是宿主细胞因癌细胞入侵而过量产生的正常细胞组分 肿瘤标记物及其相关基因的检测，将有助于hcc的早期发现和诊断，并能有效 用于肿瘤病变程度及预后判断，为治疗方案选择和病情动态观

51、察提供依据。随着 分子诊断技术的发展，对hcc诊断具有价值的肿瘤标记物正逐渐被人们发现， 这些标志物涉及肝癌的蛋白质抗原、酶和同工酶、细胞因子、相关基因等几个方 面，然而在单项测定这些肿瘤标记物时其灵敏性、特异性，或在临床运用的实用 性等方面或多或少都存在一定的局限性。甲壳质酶蛋白40 (ykl-40),是于1992年johansen等【刃在一项骨蛋白的体 外研究实验中，发现人骨肉瘤细胞系mg63的体外培养能大量分泌一种蛋白。ykl40(基因库编号：m80927)属于哺乳动物蛋白质组，其一组氨基酸序列类似于细菌几丁质酶18糖基水解酶组叫johansen等在一系列正常组织类型的cdna库中发现y

52、kl40基因：脂肪、肾上腺髓质、骨骼、骨齟、脑组织、软骨、子宫颈、大肠、内分泌腺、眼睛、胃肠道、泌尿生殖器、生殖细胞、肾脏、肝脏、 肺、淋巴结、乳腺、神经组织、卵巢.胰腺、垂体、胎盘、视网膜、脾、骨膜和 子宫吻。在体外试验中，下列人类细胞株均分泌ykl40：骨肉瘤，恶性胶质瘤,神经胶质瘤，前列腺癌和恶性黑色素瘤。免疫组化研究证实，ykl40蛋白高度表达于乳腺癌、结肠癌及神经胶质瘤活检癌细胞中卩戮在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎以及酒精性肝病中，血清ykl40浓度与肝 纤维化及肝硬化程度相关【心刃。在乙型肝炎病毒感染者中，慢性肝炎患者与乙型 肝炎肝硬化患者血清ykljo水平有明显差别。在丙型肝炎病毒

53、感染者中，血清 ykl.40水平与丙型肝炎病毒所致的肝纤维化严重程度有关"1,同时，ykl-40 在评估肝纤维化程度以及预测干扰素抗病毒治疗疗效中，可能是一种有效的非血 管侵入性检査指标皿忙在酒精性肝硬化、肝炎后肝硬化及肝炎后肝纤维化患者 中，血清ykl40浓度明显高于正常人及脂肪肝患者。camilla等研究了370例 酒精性肝病患者，随访470天，其血清ykl4）和puinp水平均显著升高，这与酒 精性肝病患者出现肝纤维化相关，也提示了这类患者预后不佳。ykl40生物学功能不完全明确，但它被认为通过生长因子样活性参与炎症 介质活动和细胞外基质重建。此外，一些研究表明ykl40在肿瘤

54、细胞増殖及侵 袭发挥着重要作用【。另有许多研究报道血清ykl40作为肿瘤标志物在预测癌 症患者预后生存期有明确价值却。ykl40能否在肝细胞癌诊断中作为一种新 的肿瘤标志物仍不明确。到目前为止，本研究是首次报道ykl40在肝细胞癌患 者中的表达，本研究结果表明ykl40在肝癌组织中的表达明显高于癌旁肝组织。 相较于非活动期乙型肝炎病毒携带者，肝细胞癌患者血清ykl40水平显著升高， 93%的肝癌患者血清ykl40水平在100ng/ml以上（见表3）。这些结果表明ykl40 在肝细胞癌组织及血清中均高度表达。因此，ykl40作为一种新的肿瘤标志物 可能在检测肝细胞癌具有一定的潜在价值。）浓 其

55、类在肝病中ykj40的细胞来源不是很明确，目前推测与肝纤维化密切相关的 肝星状细胞可能分泌ykl40。肝星状细胞在肝纤维化形成中发挥着重要的作用， 它们在diss腔与肝细胞及内皮细胞有密切接触绍。但是在本研究中，结果表明人 肝星状细胞株lx2几乎不表达ykl40mrna （见表3）,这可能是由于lx2细 胞仅具有早期未活化星状细胞的形态学特征，而不具备星状细胞生化功能有关 卩叫肝星状细胞是否是ykl-40细胞来源需进一步证实。在我们的研究中，肝细 胞癌hepg2、lm3和huh7细胞株能表达高水平ykl-40 mrna. lau等通过基 因芯片检测，在原发性肝细胞癌h2p细胞株研究中证实了簇生因子能明显上调 ykl40基因表达，提示cluy