《(论文)_病毒潜伏膜蛋白介导一异源的调节_[全文]》

1、eb病毒潜伏膜蛋白1介导c-jun/jun b异源二聚体对cyciin d1的调节*宋鑫陶永光曾亮杨静唐发清黎民敬龚建平吴乔®曹亚叶（中南大学湘雅医学院 肿瘤研究所，长沙 41007& laboratory of molec i»ar t«x?inology saic-frederick, nationalcancer institute, frederick, md 21702, usa; 羊中科技大学i司幼医学院分子医学中心，武汉430030;厦门大学生命科学院细泡生物学与肿瘤细宛工程教育部重点实验室，厦门361005）摘要研究发现lmf1可介导c-j

2、un/junb活性异源二聚体的形成，在此基础上，利用建立的tet-on系统调逵lkip1表达的细胞系，采用间接免疫荧光法联合激光共聚焦荧光显微镜技术、 western blot方法、荧光素酶活性检测、super-emsa方法和流式细胞术，探讨lmp1介导c-jun/jun b异源二聚体对cyciin d1的调节功能.结果表明，lmp1介导的c-jun/jun b异源二聚体可上调 cychndl启动子活性及其表达，并影响细胞周期的行进.关键词 潜伏膜蛋白1 c-jun junb异源二聚体cyciin d1细胞周期我们最新的研究工作已经证实叫在鼻咽癌细胞 中，eb 病毒潜伏膜蛋白 1 （laten

3、t membrane protein, lmp1）激活jnk,动态调控junb和cjun表达及翻译 后修饰，介导c-jun/junb新的活性异源二聚体形成.c-jun/junb异源二聚体作为api重要的转录因 子，其功能性活化的重要证据是通过与靶基因启动 子结合，反式激活靶基因转录，调控靶基因的表达, 从而发挥细胞增殖、凋亡分化等生物学效应.因此, 为了进一步探索c-jun/junb活性异源二聚体的作用, 寻找其调控的靶基因至关重要.令人感兴趣的是，新近的文献研究，在c-jun/ junb介导的信号传导通路和细胞周期g1/s期相关重 要靶基因cyciin d1之间建立起新的直接的联系.利 用人

4、hela细胞系研究证实,c-jun在靶基因cyciin d1 启动子上有两个api样结合位点用以激活cyciin d1 启动子叫 新近的研究表明,junb和cjun为相互拮抗 转录调节因子,junb/c-jun这一比例决定cyciin d1在 早g1期的转录与细胞周期的平衡；在细胞周期过程2004-03-12 收稿,2004-09-02 收修改稿国家重点基础研究发展规划（973计划x批准号：g199805120i）.国家自然科学基金（批准号：30300403. 30100005. 30000087）和国家杰出青年 科学基金（批准号：39525022）孫助项目"联系人,e-mail:

5、ycao98science in china ser. c life sciences中,junb和ejun的磷酸化增强其转录活性，并调节 junb/ c-jun的动态平衡，最终调控cyclin d1启动子 活性，影响其表达叫我们前期的研究工作已经证实，在mrna水平 上，用 atlas human cdna expression array i (clon- tech公司)检测人体正常鼻咽组织与鼻咽癌组织基因 表达，发现鼻咽癌组织cyclin d1表达上调在蛋 白质水平上，我们已初步证实cyclin d1在人体鼻咽 癌组织异常过表达，表明可能与鼻咽癌的发病有关; 在由鼻咽柱状上皮单纯性增生/

6、化生、异型增生/化生 和鼻咽癌癌变多阶段过程cyclin d1表达呈增高趋势, 其中在异型增生/化生中呈“一过性增高“，提示cyclin d1蛋白过表达可能为鼻咽癌发生过程中的早期事件, 异型增生/化生可能是鼻咽癌癌变多阶段的逐要“关 卡“ 进一步的研究工作表明，eb病毒lmp1通过其 介导的nf-kb, ap-1信号传导途径及其之间的 cross-tolkl89可能整合信号于细胞周駅重要调节因 子cyclin dll，0j,从而参三嶷咽细範僧殖紊乱及凋 亡失控i叫 上述大童的匸作基础擬示:cyclin d1很可 能受eb病毒lmf1诱2龙形成的c-jun/junb异源二聚 体的异常调控.我们

7、在前期研究工作基础上，进一步研究 c-jun/junb异源二聚体对细胞周期相关電要杷基因 cyclin d1的调控作用.该分子机制的阐明.有助于从 一个新的角度重新审视eb病毒lmp1功能性活化 c-jun/junb异源二聚体的意义.1材料与方法1.1细胞株和培养条件tet-on-lmpl hne2鼻咽癌细胞系【为本所构建 的、lmp1表达受四环素衍生物强力霉素(doxycyc- line.dox, sigma公司)调控的鼻咽癌细胞系,lmp1被 dox诱导表达呈时间依赖性和剂量依赖性增强.该细 胞培养条件：含15%小牛血清的rpmi 1640 (sigma 公司).379. 5% co2.并

8、维持 200 mg/l g418 (sigma 公司)和50 mg/l潮靠素(sigma公司)药物筛选浓度下 进行培养.1.2细胞总蛋白和核蛋白的抽提根据文献抽取细胞总蛋白i和核蛋白，-70-c贮存.用bca(pierce)检测蛋白质浓度.1.3 western blot 分析取100 gg蛋白在不连续sds-page胶电泳，电 转移至硝酸纤维膜(schleicher & schuell)上，再相应 地加入一抗、二抗，ecl试剂(pierce)显示蛋白带.抗 体使用如下：lmp1抗体购自dako公司(cs1-4); c-jun/ap 1 (d)-g(sc-44-g), c-jun 抗体

9、(sc-1694), junb (sc-8051), cyclin dl(h-295)和 a-tubulin 抗体(sc-5286) 购自santa cruz公司.1.4质粒抽提和瞬间转染按照质粒抽提试剂盒说明(qiagen, cat.no. 12163)抽提质粒:按照转染试剂说明 (qiagen)在6孔培养坂(5曲门中进行质粒瞬间转 铢；通过荧光嘲试剂盒(promcga, cat:e4531)分析 lmti对cyclin d1启动子的调节活性；采用统计软件 spss 11.0 one-way anova对荧光素酶活性检测结 果进行单因素方差统计分析；采用p-galactosidase活 性检

10、测试剂盒(promega, cat:e2000)校正转染效率. 有关质粒的使用：cyclin d1荧光酶报道质粒由m. strauss 博士惠赠；p-galactosidase 表达质粒(prsvp- gal)由 n. d. perkins 博士 患赠1.5激光共聚焦荧光显微镜(laser confocal fluorescence microscope, lcfm)检测用 0.6 gg/ml dox 诱导 tet-on-lmpl hne2 鼻咽 癌细胞，在0,2,4, 8, 12,24 h不同的时间点收获；pbs 漂洗；4*c预冷的3.7%多聚甲醛(pbs配制)4x2固定、 漂洗；取出盖玻片

11、置于载玻片上加cyclin d1 一抗孵 育(h-295, santa cruz)过夜；加针对 cyclin di htc 标 记的二抗(f1202, sigma), 4c湿盒过夜，漂洗，封闭 剂(含防淬灭剂)封片；激光共聚焦荧光显微镜下(bio rad, mrc 1024es)观察，lasersharp软件对结果进行 分析处理.1.6 凝胶电泳移动迁移率检测(electrophoresis mobility shift assay, emsa)根据lightshift化学发光凝胶电泳移动迁移率 检测试剂盒(pierce, no.20148)进行操作.为了分析science in china

12、ser. c life scienceslmp1(a)dox 处理 /h 00.51248121824a-tubulin(b)图1(a) western blot分析不同浓度dox诱导下tet-on lmp1 hne2细胞 lmpi蛊白表达的改变.不同剂量dox处理细胞.100 pg第白在8% sds-page电泳.转膜.lmpi 一抗孵育，二抗科育.ecl发光.x线胶 片显带.a-tubulin为内对照校正实验.(b) western bloi分析0.6 pg/ml dox诱导下teion lmpi hne2细胞lmpi蛋白表达在不同时间点的 改5. 0.6 gg/ml dox在不同时间段处

13、理细胞.100 pg资白在8% sds-page电泳.hu. lmpi 一抗需 二抗科育ecl发光.x找胶 片显带.a-tubulin为内对照校正实验c-jun/junb异源二聚体与人cyclin d1启动子区结合 能力，根据文献设计针对人cyclin d1启动子区两个 api 双链探针(探针 1: 5 -aaaaaatgagtcagaa- tggag-3*和探针 2: 5 -caacagtaacgtcacacg- gac3?,同时,根据文献设计api双链探针(5 ttccggctgactcatcaagcg-3,)序列山刈和 sp 双链探针(5*-attcgatcggggcggggcgagc-

14、3,) 序列3.20.上述探针由美国国立癌症研究院 saic-frederick分子技术实验室合成探针并用生物素 进行dna 3,末端标记.以不加相应抗体的体系作为 阴性对照，用 sp1 探针(5 -attcgatcggggcggg- gcgagc3)作为校正实验(结果未显示).c-jun (sc-1694), junb(sc-8051)和 c-jun/apl(d)-g(sc-44-g) 抗体购自santa cruz公司.1.7流式细胞术dna含量分析法lxlo6细胞于70%的乙醇中固定、漂洗，离心收 集细胞，0.2 mol/l柠檬酸/柠檬酸钠髙漆处理30 ra;n, pbs漂洗，0.1% t

15、riton(pbs配制帰洗，dna染液(内 含500 gg/ml pi和0.1爲rnase a)室温避光染色30 min,流式细胞仪(机器型号：elite,激光波长：488 nm;功率：15 mw, beckman-coulter 公司，美国)检测, multycycle软件(pheonix公司，美国)进行 dna周期分析，计算细胞各期的百分数.1.8流式细胞术双參数分析法2xl06细胞于-209纯甲醇中固定，离心收集细 胞；0.25% triton x-100(pbs 配制)冰上处理 5 min, pbs洗涤；加入1% bsa稀释的cyclin d1抗体(稀释 浓度为1 : 100) (dc

16、s-6, dakor孵育过夜；加入 fitc 标记的二抗(1 ： 40 稀释)(f2266, sigma),室温 下避光再育30 min;洗涤后用500 pg/ml pi和0.1% rnase a室温避光染色30 min;同型对照采用igg同 型非特异性抗体以排除实验中的非特异性结合.经 上述处理的细胞悬液，荧光标记成功后，应用 facsort流式细胞仪(becton dickson,美国)检测，经 488 nm激光激发，被标记细胞发射的红色(pi)和绿 色(fitc)荧光分别被facsort流式细胞仪的标准透镜 接收.应用cellquest软件(becton dickson,美国)对上 述所

17、测细胞进行分析.2结果2.1 eb病毒lmp1介导下c-jun/junb异源二聚 体具有与cyclin d1启动子结合的活性利用tet-on lmp1 hne2细胞，加入不同浓度的 dox (0.006-6.0 pg/ml)诱导 lmp1 表达，western blot 结果表明lmp1表达在0.6 gg/ml剂诱导下达到高 峰，6 ig/ml剂量诱导下lmp1表达维持在几乎同样 水平(图1(a),因此,我们采用0.6 gg/ml的dox诱导 剂量，检测不同时间的lmp1表达水平.结果表明, 随着dox诱导时间的延长，eb病枣lmp1蛋白表达 呈时间依赖性增强(图1(b).dox处玫/pgnj

18、/1 ()0.0060.060.66gm我们新近的研究证明.0.6 pg/ml dox诱导lmpi 表达后12 h能够有效地促进c-jun/junb二聚体形成, 同时与api dna结合活性显著增强.因此，用同样 的条件处理细胞并提取细胞核蛋白，结果发现, c-jun/junb异源二聚体组分c-jun和junb均具有与 cyclin d1启动子区探针1结合的活性(图2),这为进一api抗体 c-jun抗体(a)api抗体jun b抗体(b)图 2 super-emsa 方法分析 0.6 gg/ml dox 诱导 tet-on-lmpl hne2 细胞 12 h 时 c-jun/junb 异源二

19、聚体与 cyclin d1 启动子探针结合的活性()检测cjun亚基与cyclin d1启动子探针的结合: 检测jun b亚基与cyclin d1启动子探针的结合.0.6 ug/ml dox处理tet-on-lmpl hne2细 胞12 h.提取檯蛊白.5昭核後白和20 fmol 3'末段生物素标记双琏探甘卿育,c-jun或jun b抗体加入20pl反应体系.spl双橇探针作为校正实验步研究c-jun/junb异源二聚体对cyclin d1的调节作 用提供了实验依据.2.2 eb病毒lmp1介导c-jun/junb异源二聚体 激活cyclin d1启动子，上调其表达将cyclin d1

20、荧光酶报道质粒和卩即1校正质粒共 转染tet-on丄mp1 hne2细胞结果显示，不同剂量 dox诱导24 h后，与未诱导相比,cyclin d1荧光素酶 活性逐渐增加，在6 gg/ml dox诱导浓度，cyclin d1 荧光素酶活性增加到6倍以上(p < 0.05)(图3).在确定eb病毒lmpi介导下c-jun/junb异源二 聚体具有与cyclin d1启动子结合活性和调节启动子 转录活性的实验基础上，进一步研究其对cyclin d1 蛋白表达水平的调节.结果显示：cyclin d1蛋白表达 呈剂量依赖性增加(图4),表明lmp1调节cyclin d1 上调呈剂量依赖效应.利用荧

21、光标记联合激光共聚焦荧光显微技术, 以不加dox诱导为对照，分别检测不同的时间点0.6 gg/ml诱导lmp1表达的情况下，定性分析cyclin d1 在细胞核分布变化.结果显示.在激光共聚焦荧光显 微镜下，fitc标记的cyclin d1蛋白发出绿色荧光；pi 衬染细胞核发出红色荧光.在dox诱导tet-on-lmplscience in china ser. c life sciences图3不同剂量dox诱导下cyciin d1启动子相对活性改变 不同浓度dox处理细胞.裂解液裂解细胞.单光子检测仪检测荧光酶 活性.结果为3次实验的平均值（示p < 0.05,与0 pg/ml do

22、x处理组 比较）0gal表达质粒作为内对照校正实验/pg ml-1cyciin dia-tubulin图4 western blot方法分析不同剂：ft dox诱导对cyciin di蛋白表达的形响不同剂的dox处理细胞.100 jxg蛋白在10% sds-page电泳，转膜, cyciin di 一抗需育.二抗孵育.ecl发光.x线胶片显带. arubulin为内对照枝正实验dox 处理 00.0060.060.6hne2细胞后2, 4和8 h时间点，有广泛的相互叠加 的黄色荧光分布，但是12 h时间点黄色荧光在细胞 核分布明显减少,24 h时间点几乎消失（图5）.进一步采用western

23、blot方法定量分析0.6 gg/ml dox诱导下，lmp1介导cyciin d1表达的时间效应, 结果表明> cyciin d1表达0.5 h开始增强，并维持较高 水平直至8 h,从12 h开始下降，24 h表达十分微弱 （图 6）.2.3 eb病毒lmp1介导c-jun/junb异源二聚体 通过调控cyciin d1表达形响细胞周期的行进在发现lmp1介导下形成的c-jun/junb异源二 聚体，增强cyciin d1启动子活性，上调cyciin d1表 达的实验基础上，我们进一步利用流式细胞术dna 含量分析方法，以不加dox诱导为对照，在0.6 yg/ml dox诱导下，检测t

24、et-on lmp1 hne2细胞在 高水平持续表达的cyciin d1作用下不同时间点细胞 周期变化.结果发现,dox诱导后几乎各个时间点g1 期细胞百分数不同程度地升浅；s期和g2期细胞百 分数不同程度地下降（表1,图s为了更进一步阐中上述细胞周期的细胞百分比 改变与cyciin d1表达时相的相关性，我们利用dna 含量和平均荧光强度双参数方法检测cyciin d1.结 果表明，在dox诱导仅仅0.5 h内，cyciin d1平均荧 光强度明显升高；在0.5至8h内，维持在较髙水平的 平台期内；8至24 h则明显减弱（图8）.3讨论我们前期的研究工作已经证实，鼻咽癌细胞中 eb病毒lmp

25、1通过tradd和traf激活jnk】, 上调api转录活性122-231,增强api dna结合能力叫 同时发现，鼻咽癌细胞中lmp1活化cyciin d1的表 达i,导致细胞增殖紊乱我们最新的研究工作 证实：在鼻咽癌细胞中，lmp1介导c-jun/junb活性 异源二聚体形成.在上述研究工作基础上，本文的研究发现, lmp1介导c-jun/junb异源二聚体调控cyciin d1启 动子活性及其蛋白表达（图35）,这为进一步阐明dox(-)/gl55.853.95349.241.74857.865.766.3dox(4-)/g155.857.755.152.542.452.25870.27

26、4 1dox(-ys40.843.243.748.952.140.629.524.126.4dox(>)/s40.840.242.64651.836.52&620.921.7dox(-)/g2342.93.2l98.711.4u.510.27.3doxg)/g23.422.31.55.811.313.48.94.2时间点/h 表10.6 gg/ml dox诱导下telon丄mp1 hne2细胞在不同时间点的细胞周期时相分布/%时相doxohcyclin dipimerge8h12h24 h图5间接免疫荧光法和激光共聚焦显微镜示lmp1调控cyclin d1在核内的分布tet-on

27、 lmpl hne2细胞加入0.6 hg/ml dox处理不同时间.以激光共聚焦显微镜观* cyclin d1蛋白的核内分布.绿色荧光为fitc示cyclin d1蛋白.红色荧光为pi特异细据核染色 cyclin d1若存在核定位.则出现黄色的叠加信号science in china ser. c life sciencesdoxtt3/h 00.5 i 248121824图6 western blot方法分析不同时间dox诱导下lmp1调 控cyclin d1蛋白表达变化06p”mldox在不同时间段处理细独100 pg £白在io%sdspage 电泳，转良cyclin d1 一

28、抗需育.二抗禅育，ecl发光x线胶片显带. a-tubulin为内对照校正实验807060504030201000 0.5 i 24812 1*74 h dox (-”g1 -o-dox (+)/gl 古 dox (-ys f - dox (+)/s 亠 dox tg2(+)/g2图 7 0.6 gg/ml dox 诱号下 lmpi 诡控 tet-on-lmpl hne2细胞在不同肘间点的细胞周期时相分布 0.6pg/mldox在不同的时间段处理细w. 70%乙解中固定,pi染核，用 beckman-coulter公司流式细胞仪检測 multycycle软件分析图8 0.6 jig/ml do

29、x诱导下lmp1调控不同时间点的 tet-on-lmpl hne2细胞在细胞周期中cyclin d1平均荧光 强度变化0.6 jxg/ml dox衽不同时间段处理细胞.-20纯甲醉固定.fitc显示 cyclin d1萤白.p1显示dna含量，采用facsort仪双掺数分析 cyclin d1荧光强度lmp1通过api信号传导途径对细胞周期直接调控 所产生的生物学效应提供了重要的实验依据.细胞周期不同时相间存在着gl/s, g2/m等一系 列类似“开关”式的关键检测点，具有监视和调控细胞 周期时相的作用，使其正常转换，以保证各个细胞周 期事件的启动.完成，忠实地按序进行.其中g1/s 检测点至

30、关重要以】.肿瘤是一类细胞周期性疾病1旳.细胞周期受一 系列因子的共同调控.其中最主要的是一组cyclin蛋 白，而与肿瘤关系最密切的首推cyclin d1261,当细胞 受刺激进入周期后最早表达的是cyclin di, cyclin di 成为连接外界生长因子、信号转导与细胞周期的纽 带0）. cyclin di作为调节细胞周期行进的g1zs检测 点相关重要正性调节蛋白，与cdk4结合并激活其活 性，进一步调节prb的磷酸化状态.最终决定转录因 子e2f的释放，促进dna合成.使细胞进入s期，用 以准确协调地驱动细胞周期进行"如；相反，用cyclin d1/cdk4选择性抑制剂in

31、dojocarbazoles则可使肿瘤 细胞停止生长，阻滞于g1期研来表明，疋恋忆况下.处于对数生长期的细胞, 在有丝分裂潦的刺激下，cyclin d1在go期细胞表达 达到高峰；cyclin d1的出现仅限于g0期和g1早期, 被认为是细胞g0到g1期转换的细胞周期重要标志 蛋白，进入s期前降解，多数情况下s, g2/m期表达 阴性澀巩 新近的研究表明.cyclin d1瞬时表达足以 促进细胞的正常复制和生长卩4）,过表达则引发细胞 周期驱动机制不断加强,g1/s检测点失调）；细胞一 旦越过g1/s期检测点，细胞周期的行进就处于不可 逆的状态叫 可能引发细胞异常增殖刚，启动受损 而未经修复细

32、胞进入细胞周期的下一个时相.导致 基因组不稳定性增加卩刀，加速肿瘤的恶性演进以）.我们前期的研究工作表明.lmp1通过api信号 传导通路加速鼻咽癌细胞增殖亠】.本文进一步的 研究结果显示：随着lmp1介导c-jun/junb异源二聚 体形成增多,cyclin d1启动子荧光酶活性逐渐增强 （图4）, cyclin d1蛋白表达（图4“）以及与细胞周期 相应的平均荧光强度逐渐增强（图8）并维持在较高水 平.在此情况下，流式细胞术的实验结果提示：过多 的g0期（静止期）细胞重返细胞周期进入g1期，进入 细胞周期（s期和g2期）的细胞更快速地跨越细胞周 期，进入下一次细胞分裂（表1.图7）.从而可

33、能引发 g1/s检测点失调，细胞异常增殖，并进一步加剧肿 瘤细胞的恶性演进.该研究在外界致病因子eb病毒 lmp1, api信号传导通路和细胞周期之间建立了新的直接联系，为肿瘤发病机制研究提供并补充了新 的思路和实验模式.參 考 文 献i宋 .厲永光. 亚.尊eb病漕伏農蛋白i介导活性 c-jun/jun b异源二聚体形成.中国科学.c辑.2004. 34(4): 3243342 herber b. truss m. beato m. et al. inducible regulatory elements in the human cyclin di promoter. oncogene.

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