微生物综合实验：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定

1、土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及其淀粉:活力的测定姓名：李青嵘 班级：生工102 学号：1014200044同组组员：黄得风 同组组员：张旭霞摘要本实验通过90°c水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选择性淀粉 培养基和稀释涂布平板法对十壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，又通过分区 划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到w株纯培养的芽孢杆菌。并通过耐盐试 验、明胶试验、糖发酵试验、vp试验、吲哚试验，等多项生理生化实验对筛选 出来的菌种进行鉴定，鉴定结果均为蜂房芽孢杆菌。进一步通过3, 5-二硝棊水 杨酸显色法对菌种的淀粉酶活力进行鉴定，测定结果分别为10.68mmu, 12.6

2、4mmu。关键词：淀粉酶，芽孢杆菌，酶活测定1.前言淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶的总称，广泛存在于动物、植物和微生物中。 目前淀粉酶广泛应用多种领域，在发酵工业中淀粉酶可用于淀粉原料的液化及糖 化工艺；在食品工业中淀粉酶可用于面包焙烤，使其体积更大，颜色更好，颗粒 更柔软；在农业屮淀粉酶可作为饲料添加剂，降解饲料屮淀粉营养成分以利于动 物吸收利用；此外，淀粉酶在医疗卫生、废料处理、纺织印染等领域都冇广泛应 用。目前牛.产应用的淀粉酶主要来源于微牛.物，并集中在几种细菌和真菌中，尤 其以芽孢杆菌所产的淀粉酶较多。其原因首先芽孢杆菌属(bachlus)中能产生淀粉 酶的菌种较多；其次，芽孢杆菌属产

3、的淀粉酶有较好的应用价值，如凝结芽孢杆 菌、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌产的淀粉酶具有耐热性；再次, 芽孢杆菌应用历史悠久，广泛用于饲料添加剂，其安全性有保证。本文主要从土 壤中筛选产淀粉酶的芽孢杆菌，分离纯化，并进行酶活测定，从而获得有经济价 值比较高的菌株。2.材料与方法2.1.实验材料2.1.1. 土样的釆集从广州大学b-8门前采集土样？ g，每天加入2 g淀粉和10 ml水进行培养5天。2.1.2. 培养基. 筛选及活化培养基11 j淀粉20g,蛋白胨10 g, nacl 2.5 g,琼脂10g，自来水1000 ml，ph自然。. 斜面种子培养基

4、l2j牛肉膏3g,蛋白胨10 g, nac15g,琼脂1520 g,自来水1000 ml, ph 7.2 7.4；. 摇瓶发酵培养基l3j称取可溶性淀粉2 g,蛋白胨1 g,牛肉膏0. 3g,氯化钠0. 5g溶于100ml 蒸馈水屮。ph自然；. 蛋白胨液体培养基（作吲哚实验用）21蛋白胨 10g，nacl 5 g,自来水 1000ml, ph7.27.4, 121°c 火菌20min;. 葡萄糖蛋白胨培养基（vp和mr试验用）l2j蛋白胨5g，葡萄糖5g, nacl 5 g,自来水1000 ml, ph 7.2t4，121°c灭

5、菌20 min；. 糖发酵培养基（作细菌糖发酵试验用）2蛋白胨2g, nacl 5 g, k2hpo4 0.2 g, 1%溴麝香草酚蓝水溶液3 ml,待试糖 10 g（般糖或醇按1 %量加入，而半乳糖、乳糖按1.5 %的量加入），自来水1000 ml，ph 7.27.4;. 酪氨酸平板（作酪氨酸水解试验用）l酪氨酸0.5g悬浮于loml蒸饱水中，20分钟灭菌，然后于100ml无菌的营 养琼脂混合，即成酪氨酸水解平板；. 酪素平板（作酪素水解试验用）取5g脱脂奶粉加入50ml蒸馏水中（或用50ml脱脂牛奶），另称1.5g琼脂溶 于50ml蒸馏水中，将两液

6、分开灭菌。待冷至45 50°c时，将w液混匀倒平板， 即成牛奶平板；. 西蒙斯氏柠檬酸盐培养液（作柠檬酸盐利用试验用）2柠檬酸钠2 g, nacl 5 g, mgs04 -7h20 0.2 g, k2hpo4 -3h20 1 g，（nh4）2hpo4 1 g, 1 %溴麝香草酚蓝水溶液10 ml，琼脂1520 g,自来水1000 ml，ph 7.0，121°c 灭菌20 min；0. 淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基l2j可溶性淀粉2 g,牛肉膏3g,蛋白胨10 g, nacl 5 g,琼脂1520 g，蒸馏水 1000 ml, ph 7.27.4;2

7、.1.2.11. （2%、5%、7%）高盐培养基l2j牛肉靑3g,蛋白胨10 g, nacl （ 2g、5g、7g），琼脂1520 g，蒸馏水1000 ml, ph 7.27.4;2. 明胶培养基牛肉膏3g,蛋白胨10 g，明胶12g,蒸馏水1000 ml , ph 7.0；3. 半固体培养基（作运动性实验用）琼脂含量0.5%,其他组分比例按牛肉靑蛋白胨培养基配制；2.1.3.试剂和仪器.碘原液：碘llg,碘化钾22g,加水定容至50oml;. 单染色：草酸铵结晶紫或石炭酸复红；. 革兰氏染色：草酸铵结晶紫染色液，卢戈氏碘液

8、，95%乙醇，0.5%沙黄 染色液。. 芽孢染色：5%孔雀绿染色液，0.5%沙黄染色液。. v.p 试验：40%naoh 溶液，a-奈酚。. 吲哚试验：乙醚，吲哚试剂。. 硝酸盐试验：甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/l醋酸woml;乙液（a- 奈胺 0.5g + 5mol/醋酸 100ml）；. 酪素水解：牛奶；. 酪氨酸水解：l-酪氨酸；0. 淀粉酶活力测定：1% 3,5-二硝基水杨酸试剂。2.1.4.仪器：无菌培养皿，接种环，土样，三角瓶，烧杯，试管，酒精灯，无菌吸管，载 玻片，吸水纸等

9、。恒温摇床，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌箱，超净工作台，水浴 箱，磁力搅拌器，涂布器，显微镜，移液管，移液枪。2.2.实验方法2.2.1. 初筛. 制菌悬液：取五份土样各25 g,分别加入装有225ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，用摇 床振动打散，制成10'1的土壤悬液，并置于恒温水浴装置80 °c水浴，水浴锅温度 恒定后维持20min，以杀死无芽孢的细菌；. 梯度稀释菌悬液：分别取装有9 ml无菌水的试管6支，编号。取己制成菌悬液的10d的土壤悬 液，振荡静置30s,用移液器吸取iml土壤原液加入10_2的无菌水试管中，吹打3 5次，充分混匀，即成1（

10、t2土壤稀释液。同法用移液器从10_2的试管屮吸取iml稀 释液加入编号为的试管中，混匀制成土壤液，依次连续稀释为w4、10_5的土壤悬液液;. 涂布21:用无菌移液器从各浓度的土壤稀释液取50 ul于筛选培养基平板上，用无菌 玻璃涂棒涂布，充分涂布均匀。每个浓度2个平板，一个空白对照，并将接种完 成后的平板置于37°c恒温箱，倒置培养24h;. 筛选：从各个土壤悬液稀释度的涂布平板上挑取直径较大的单菌落，10个，于新的 筛选培养基中进行分区划线；2.2.2. 纯化及复筛.分区划线接种|2|:用接种环挑取10个较大菌落于筛选培养基中进行分区划

11、线，先在平板的一边 作第1次平行划线34条，在转动培养皿约60。角，并将接种环上剩余物烧掉， 待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部 分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线。划线结束后， 盖上皿盖，倒置在37 °c下恒温培养24 h。22.2.2. 单染色l2j涂片、干燥及固定；初染：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结品紫 染色液或石炭酸复红液，染1 min,倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止。 镜检：用油镜观察染色结果；.芽孢染色121涂布、干燥及固定；加染色液：于涂片上加入23滴5%孔雀绿水溶液；加 热：用

12、试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，边加热边滴加染色液，自载玻片 上出现蒸汽时，开始计时，约4 min；脱色：倾去染液，待玻片冷却后，水洗至 孔雀绿不再褪色为止；复染：滴加沙黄染色液，染23min，水洗；镜检：用油镜观察染色结果。2.2.3. 淀粉水解实验n对通过単染色和芽孢染色的镜检得到的纯培养的芽孢杆菌进行淀粉水解实 验，并从中筛选出水解圈较大的6株菌作为目的菌，进行后续实验。具体步骤如 下：挑取菌种，采用点解法接种于可溶性淀粉培养基中，每两种菌做一个平板， 并做一次平行实验和空白对照组。将接种完成的平板置于37"c恒温箱中倒置培养 24h。2.2.4. 斜面保种12:取各种无菌

13、牛肉蛋白胨斜面培养基数支，贴上标有菌株名称和接种日期的 标签，每种菌接3管，用接种环挑取单菌落进行斜面接种，加塞，包扎好后在37 °c 下恒温培养24 h，再放入冰箱4°c暂存备用；2.2.5. 生理生化试验鉴定. 革兰氏染色实验121从各纯培养的平板中挑取菌种于载玻片上，滴加无菌生理盐水，涂片、干燥 及冏定；初染：在涂有菌种的载玻片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染1 min, 倾去染液，用水冲洗至无染色液颜色为止；媒染：滴加卢戈氏碘液，染12 min, 水洗；脱色：滴加95%乙醇，将玻片摇晃几卜倾去乙醇，重复23次，立即水洗; 复染：滴加沙黄染色液，染23

14、 min,水洗；镜检：用油镜观察染色结果。. 糖发酵实验（葡萄糖）l2j用接种环将各种杆菌分别接种于葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、卄露醇的发酵管 内，每种发酵管重复两次，标记，并设置空白组作为对照（注意接种的整个过程 屮不能认为的制造气泡），接种完后，每一管外包一层无菌纸，以防污染，将全 部发酵管倒置于小烧杯内，37°c培养24h。观察记录，与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性, 表明该菌不能利用该种糖，记录用“一”表示，若培养液呈黄色，反应结果为阴性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“+”表示。培养液的杜氏小管内有气 泡为阴性反应，表明该菌分解糖能产酸产

15、气，记录用“+”表示，如杜氏小管内 没有气泡为阴性反应，记录用“一”表示。2.2.53.乙酰甲基甲醇实验（v.p试验）2j取葡萄糖蛋白胨培养液的试管，编号，以无菌操作分别接种少量菌苔至以上 相应试管中，空白对照管不接菌，置37"c恒温箱中，培养二十四小时，培养完后， 取出上述试管充分震荡2min每管分别加入40%naoh溶液1020滴，并加a萘酚, 振荡试管以使空气中的諷融入，置37°c温箱中保温15-30min后，若培养基呈红色, 记录为v.p试验阳性反应（+ ）表示，若不呈红色，记录为v.p试验阴性反应（用）表示。22.5.4.卩引哚试骑21取装冇蛋白胨水培养液的试管编

16、号，以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相 应试管中，并做空白对照，置37°c培养箱中24h,在培养液中加入乙醚l-2ml，经 充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管 壁缓慢加入5-10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰红色，说明吲哚试验 为阳性反应，否则为阴性反应。.耐盐试验21将分离获得的菌种分别接种在2%、5%、7%的高盐培养基中，设置一组对照, 一组平行实验组，并置于37°c下培养，观察生长状况，并做记录。记录方式如下： 不生长：一，生长差：+，生长一般：+，生长良好：+;22.5.6.拧檬酸盐利用试验l2j取若干装有西

17、蒙斯拧檬酸盐培养基的试管，将菌种接入试管，置于37"c恒温 箱中培养2448h。若培养基为蓝色，则表明能利用柠檬酸盐作为碳源生长，以“ + ” 表示。若培养基为绿色则为阴性，以“一”表示。.明胶试验51挑取菌种，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。 于2022°c培养714天。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶木身液化时， 应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化， 即为试验阳性，以“ + ”表示。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落 上滴加试剂，若为阳性，1020mhi后，菌落周围应出现清晰带环。否则

18、为阴性。2.2.5.s.硝酸盐还原试验51被检菌接种于硝酸盐培养基中，于35°c培养14d.将甲、乙液等量混合后（约 0.1 ml）加入培养基内，立即观察结果。结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有 被还原，试验阴性；硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这 时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红 色，表示试验为假阴性。若要检查是否有氮气产生，可在培养基管内加一小倒 管，如有气泡产生，表示有氮气生成。22.5.9.酪素水解试验l5j取牛奶平板，将菌种划线接在平板上，每皿1株菌。设置一组对照，一组平 行实验组，并置于3

19、7°c恒温箱培养，记录菌落周围和k面酪素是否己被分解而呈 透明。0. 酪氨酸水解l5j取酪氨酸平板，将测试菌接种于划线接于培养基上，设置一组对照，一组平 行实验组，并置于37°c恒温箱培养，记录酪氨酸结晶是否被水解而变透明。1. 鞭毛穿刺试验21取装奋半固体培养基的试管，使用穿刺法接种待测菌，37°c培养24h，观察 穿刺线形态，若是会运动的细菌，培养基中的穿刺线呈云雾状，倪是如果是需氧型的话会在培养基表而上形成一薄膜：若是不会运动的细菌，培养基中的穿刺线 很清晰。2.鉴定61根据从伯杰式细菌学手册芽孢杆菌属中检索到的芽孢

20、杆菌的牛.理牛.化特点，选取能从土壤中分离到的芽孢杆菌种为标淮菌种，其生理生化指标如下表:伯杰式手册芽孢杆菌属生理生化鉴定表1革兰氏耐盐vp吲哚柠懞黢明胶运动硝酸盐酪-琴on枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+w+蜡状芽孢杆菌+w+巨大芽孢杆菌+ww+多粘芽孢杆菌d+-+环状芽孢杆苗dww凝结芽孢杆菌+d一+ww蜂房芽孢杆菌d+w一+坚硬芽孢杆菌+一一w+短芽孢杆菌d+w+球形芽孢杆菌dw一差大+巴氏芽孢杆菌d一w+dd伯杰式手册芽孢杆茴属生理生化鉴定表2酪氨酸莆糖木糖阿糖甘露醇产气最髙温最低温枯草芽孢杆菌+-45-555-20地衣芽孢杆菌一+-50-5515错状芽孢杆菌+一-35-4510-20巨大

21、芽孢杆菌d+vvww-35-453-20多粘芽孢杆菌+35-455-10环状芽孢杆菌一+-35-505-20凝结芽孢杆茴+www-55-6015-25蜂房芽孢杆菌d+-35-4515-20坚硬芽孢秆菌dwww+-40455-20短芽孢杆菌+d一一w-40-6010-35球形芽孢杆菌一-30-455-15巴氏芽孢行菌-3342阳性，+,阴性：一,阳性和阴性不穂定：山弱阳性，阶通过对h的菌种进行多项生理生化实验，对比伯杰式手册的实验结果，从而鉴定出fi的菌的种别;2.2.6.产淀粉酶芽孢杆菌淀粉酶活性的测定（3, 5-二硝基水杨酸显色法） .粗酶液制备:以一环菌种接种于发酵培养基中，

22、摇床培养，160 rpm/min，37 °c，48 h。 4000 rpm/min离心20 min,收集上清液即为待测粗酶液。. lmg/ml标准麦芽糖的制备：准确称取loomg麦芽糖，用蒸馏水准确定容到100ml；. 3, 5-二硝基水杨酸试剂的制备：准确称取3，5-二硝基水杨酸lg,溶于20ml2mol/l naoh溶液中，加入 50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水定容到woml，盖 紧瓶塞，备用；. 0.1mol/l ph5.6的拧檬酸缓冲液的制备准确称取4.62g柠檬酸和17.05g柠檬酸钠，用蒸馏水定容至800

23、ml;2.2.7. 1%淀粉溶液的制备准确称取lg淀粉于looml 0.1mol/l ph5.6的拧檬酸缓冲液中;2.2.8.标准曲线的绘制标准曲线制作表1234567麦芽糖标准液（ml）0020.611.41.82蒸馏水（ml）21.81.410.60.20麦芽糖含畳mg00.20.611.41.823:5-二硝基水杨酸（ml）1. 标准样液配制按上表配制完成，摇匀，置沸水浴中煮沸10 min。取出后流水 冷却，加蒸馏水定容至20 ml。以一号管作为空白对照管，520 ntn比色测定吸光 度。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。2.2.9

24、.测定取10 ml具塞刻度试管，预先洁净火菌干燥、编号。按下表配制溶液，定容 后，摇匀，用分光光度计测定od在520 nm的值。淀粉酶活测定表1aib1 空2a2b2空粗酶液（ml）111111浓 hc1 (ml)00 10 0 预混1: 4cfc水浴lomin11?綻粉溶液（ml）11111精确保混u 40c水浴5min1浓hc1 (ml)110 1103:5-二硝基水杨酸（ml）22 2 2 2沸水浴10 min22.2.10.计算根据测到的od值，在标准曲线中找到相应的麦芽糖量，并在上述条件下以 单位体积样品在30 min释放1 mg麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位（mmu） 酶活力，按

25、下式计算出淀粉酶的活力。淀粉酶活力=麦芽糖释放量（mg） *6 稀释倍数3.结果与分析3.1. 菌株的初筛通过90°c水浴20min分别对2分土样进行预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选 择性淀粉培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，获 得12株菌，并分别点接于淀粉平板中，进行淀粉水解测定，最后挑取了3株淀粉 水解圈较大的菌株，进行分离纯化。3.2. 菌株的复筛分别通过3次分区划线，分离纯化初筛所得到的3株菌，经单染色镜鉴，鉴定 为纯培养；经芽孢染色镜鉴，观察到3号菌芽孢端生，1、2号菌芽孢中生，均为芽孢杆菌；经淀粉水解试验，发现3号菌几乎没有水解圈，1、2号菌有水

26、解圈。 采用斜面包藏法保存1、2号菌株于斜面试管屮，置于冰箱保种。图1淀粉水解试验图2 1号纯培养图3 1号单染色图4 2号单染色3.3.菌株的鉴定通过革兰氏染色、运动性试验、耐盐试验、温度试验、柠檬酸盐试验、硝酸 盐还原试验、酪氨酸水解试验、酪素水解试验、糖发酵试验、vp试验、吲哚试 验、明胶水解试验等生理生化实验，对筛选得到的菌种进行鉴定。各项生理生化实验结果如下表：生理生化鉴定原始数据表1号菌2号菌革兰氏染色+2%耐盐搬+5%耐盐搬+7%耐盐®vp试验+吲哚试验+行懞酸盐还原试验明胶水解试验+ (id)+ (id)葡糖发酵+阿拉伯糖发酵+木糖发酵+甘露醇发酵+糖宽酵产气运动性试

27、验+硝酸盐还原试验酪素水解试验+酪氨酸水解试验记温度试验10c温度试验15c海1度试验+20"c温度试验+25"c温度试验+3ctc温度试验+35c温度试验+40'g海i度试验+45'c温度试验+50t：癌1度试验55c温度试验6o'c混1度试验阳性，+;阴性，一；阳性和阴性不稳定：d;弱阳性：生长良好：+;生长一般：+;生长较差：+;不生长：-按照伯杰式细菌学手册的检索样式，对实验原始数据进行整理，整理结果如下:生理生化鉴定结果数据表1号菌2号菌革兰氏染色+耐盐试验vp试验+吲哚试验+柠懞酸盐述原试验明胶水解试验+葡糖发酵+阿拉伯糖播+木糖发酵+甘

28、露醇发酵+糖发酵产气运动性试验+硝酸盐还原试脸一一酪素水解试验+酪氨酸水解试验温度试验15-4515-45对照伯杰式细菌学手册，与芽孢杆菌属，蜂房芽孢杆菌的各项生理生化指标 完全吻合，且1、2号菌生理生化鉴定结果相同。综上所述，鉴定结果为：1、2 号菌均为蜂房芽孢杆菌。3.4.淀粉酶活力的测定3.4.1.麦芽糖标准曲线麦芽糖标准曲线公式:y=0. 2915x； r2=0. 99433.4.2.淀粉酶活力酶活力测定表a1号b空a2号b空0d值0.2560.26300.3010.3120麦芽糖含畳（mg）0.8780. 90201.0331.0710稀释倍数222222酶活力（mmu）10. 53

29、610.824012.39612. 8520平均酶活力10. 6812.6244.讨论4.1. 菌株的筛选本实验通过90°c水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，再以弱选择性淀粉 培养基和稀释涂布平板法对土壤中产淀粉酶芽孢杆菌进行初步筛选，又通过分区 划线法对初筛菌株进一步分离纯化，得到纯培养。对比同班同学的其他筛选方案， 如先获得纯培养，再筛选产淀粉酶的菌株等，本实验方案的实行效率更高，操作 也较为简单。4.2. 生理生化鉴定本次实验通过多项生理生化试验鉴定菌种，在实验过程屮，由于缺乏经验， 操作不熟练，通常导致实验结果不稳定，其至是错误。例如，糖发酵试验，我们 对培养了 24h的糖发酵管进行观察，没发现现象，便将其倒掉，而不是继续培养 观察，还有其他儿项生理生化试验也是如此，后来在对照伯杰式细菌学手册时， 发现没有和吻合的菌种，最后才通过从新实验，获得真实数据。4.3. 酶活力测定本次实验在酶活力的测定过程屮，标准曲线的制作存在较人的误差，主要原 因有一下几点：首先，是标准曲线制作的方法不标准，大多是来源于豆丁网的文 档；其次，操作不规范，毡括移液器的使用，分光光度计的操作等；最后是，仪