BTB-Kelch蛋白KLHL32编码基因的克隆及初步鉴定

1、btb-kelch蛋白klhl32编码基因的克隆 及初步鉴定王妮，陈新玉，欧小利，姜勇，梅柱中(南方医科大学皋础医学院广东省蛋白质组学重点实验室，广东广州，510515) 摘要：h的：克隆人btb-kelch家族蛋白klhl32编码基因并初步鉴定其在细胞屮的功能。 方法：采川荧光实时定星pcr分析tlr5特界性激活剂st-fla刺激经pma诱导分化的 thp-1巨噬细胞中klhl32基因表达水平的变化，应用rt-pcr克降了人klhl32编码区 cdna序列并将英克隆至真核农达载体pcdna3.1,采川荧光素酶双报告基因表达系统分析 klhl32过表达对转录因子nfkb基因活性的影响，并釆用免

2、疫共沉淀实验分析了 klhl32与cul-3蛋白在细胞内的相互结合。结果：1 ()()ng/ml st-fla刺激4h诱导经pma 诱导分化的thp-1巨噬细胞中klhl32基因表达水平下调，成功克隆了人klhl32编码基 因并将英克隆至真核表达载体中获得重组质粒pcdna3.1-klhl32-flag,在hek293细胞 中过表达klhl32蛋白对tnfa诱导的转录因子nfkb激活没有明显影响，但klhl32 可通过其氨基端的btb结构域与cul-3和互结合。结论：成功鉴处了人klhl32蛋白的编 码基因，其通过btb结构域与cul-3蛋口和互结合，可能是一种潜在的e3泛素连接酶，证 实了

3、tlr5受体激活可诱导其表达水平的下调，提示klhl32蛋白在细胞中町能参与了炎症 细胞信号转导通路的调控。关键词：klhl32； e3泛素连接晦；tlr5受体 中图分类号：q786, r392.llcloning and preliminary characterization of klhl32, anovel human gene encoding a btb-kelch proteinwang ni, chen xinyu, ou xiaoli, jiang yong, mei zhuzhong(key laboratory of functional proteomics of gu

4、angdong province, department ofpathophysiology, southern medical university, southern medical university, guangzhou510515, china)abstract: aim: to identify and characterize human klhl32 gene, a member of btb-kelch family. methods: real-time pcr was applied to analyze the expression of klhl32 gene in

5、 pma-induccd thp-1 macrophage like cells the full length of human klhl32 coding region was amplified by rt-pcr and the amplicon was subcloncd into eukaryotic expression plasmid pcdna3.1. the effects of overexpression of klhl32 on tnfa induced activation ofnf-kb was analyzed with dual-luciferase repo

6、rter assay system. and the interaction between klhl32 and cul-3 was analyzed by co-immunoprecipitation assay. results: the expression of klhl32 was downregulated in pma-induced thp-1 macrophage cells upon loong/ml st-fla treatment. human klhl32 has been successfully cloned and subcloned into eukaryo

7、tic expression plasmid to get recombinant plasmid pcdna3.1-klhl32-flag. overexpresion of klhl32 in hek293 cells didift interfere the activity of transcription factor nf-kb activated by tnfa treatment. and klhl32 interacts with cul-3 protein through its btb domain. conclusion: human klhl32 gene has b

8、een identified for the first time .it can interact with cul-3 through its btb domain and may function as a potential e3 ubiquitin ligase in cells the activation of tlr5 receptor leads to the downregulation of klhl32 which suggests that klhl32 may play a role in the cellular inflammatory response.key

9、 words: klhl32, e3 ubiquitin ligase, tlr5 receptor基金项ii：教冇部新教师基金项ii (20104433120009)；国家口然科学基金(81070955) 作者简介：王妮(1988j ,女，硕士研究生.炎症的信号转导通信联系人：梅柱中(1973-),男，副教授，炎症的信号转导机制mzhuong 泛素（ubiqutin）是-种从低等的酵母到高等的哺乳动物细胞屮高度保守的蛋白 质，可通过其竣基端的甘氨酸残基与靶蛋白分子中特定的赖氨酸残基形成共价连 接，被称之为蛋口质的泛素化修饰，是蛋口质翻译后修饰的一种重要形式。依底 物蛋口质分子屮形成的多聚泛素

10、链的不同可促进其通过26s蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome system）被降解（如通过k48形成的多聚泛素链）或调节 其在细胞中的功能（如通过k63形成的多聚泛素链）。在细胞中，蛋白质的泛 素化修饰需要e1泛素激活酶（ubiquitin activating enzyme）、e2泛素偶联酶（ubiquitin conjugating enzyme）与 e3 泛素连接酶（ubiquitin ligase）的依次参与， 其中e3连接酶处于核心的地位，它通过与底物蛋口质的直接结合而促进其发生 泛索化修饰，保证了发生泛索化修饰的底物蛋白质的特异性。目前在哺乳动物 细胞中已经被鉴

11、定的e3连接酶超过600种，依据其结构的不同可以大体上划分 为两大类:hect家族蛋白与含有ring结构域的e3连接酶，其中前者是单一 亚基的酶类，可直接促进底物蛋白质分子的泛素化修饰，而后者多是市多个亚基 组成的、以蛋白复合物的形式来行使e3连接酶的活性。在含冇ring结构域的e3连接酶屮，2003年被鉴定的含冇btb-kelch结构 域的蛋白家族（klhl蛋白家族）备受大家关注，该家族成员典型的特征是在其 氨基末端含冇保守的btb结构域，在其竣基端含冇56个kelch结构域，它们 可通过btb结构域与cul-3/rbxl结合形成e3连接酶复合物，而通过其竣基端 与底物蛋白质分子结合35。该

12、家族成员在进化屮高度保守，提示它们在细胞屮 具有重要的生理功能，但在已被鉴定的42种成员中，除了少数儿种之外，绝大 部分的成员的功能目前尚不清楚6。我们在前期对美国ncbi高通量基因表达数 据库进行分析吋，发现采用tlr5受体的特异性配体鞭毛蛋白（flagellin）刺激 cd11c+的小鼠小肠粘膜固有层（lamina propria）细胞4h可诱导klhl家族蛋 白屮的klhl32表达水平的下调（数据库编号：gds2212）,提示其可能与细 胞的炎症反应调控有关。为了进一步的分析klhl32蛋口在炎症反应中的功能， 我们从采用pma诱导分化的人thp1单核巨噬细胞中克隆了该基因，并对其功 能

13、进行了初步的分析，为后续深入研究klhl32蛋白在细胞炎症反应屮的功能 打下了良好的基础。1材料与方法1.1实验材料真核表达载体pcdna3.1flag、thp-1细胞系和hek293细胞系（本室保 存）,dna ladder. kod plus dna 聚合酶、revertra ace qpcr rt kit （toyobo, 日本），限制性内切酶、t4 dna连接酶（thermo公司，美国），质粒捉取试 剂盒、凝胶回收试剂盒与sybr green real-time pcr试剂盒（promega公司，美 国）,trizol 总 rna 提取试剂、lipofectamine ltx 转染试剂

14、盒（life technology 公司,美国）,anti-flag m2抗体与佛波酯（pma） （sigma- aldrich公司,美 国），st-fla （invivogen 公司，美国），anti-cul3 兔单克隆抗体（epitomics 公司，美国），anti-mouse igg, hrp-linked antibody （cell signaling technology 公司，美国）。引物合成及测序由life technology公司（美国）完成。1.2定量pcr检测c57bl/6小鼠不同组织klhl32基因的表达颈椎脱臼法处死c57bl/6小鼠，将新鲜取出的心、肝、脾、肺、肾、

15、脑、 肌肉、皮肤等八种组织装入冻存管中，置于液氮中进行速冻，半小时后取出组织 加一定量液氮充分研磨至完全粉碎。按每50mg组织样品加trizol® reagent 1ml 的量加入适量的trizol试剂，提取组织屮总rna并釆用real-time pcr对不同 组织屮klhl32 mrna表达水平，以p-actin为内参照。采用的pcr扩增引物， 小鼠 klhl32 上游引物为：5 -cagcaaagaagtgatggcattc-3 ,卜'游引物 为：5 gctccactttccaccatacaaag-3 。小鼠卩-actin 扩增一上游弓i物为： 5 acggccaggtc

16、atcactattg-3 , 下游引 物为：5 agaggtcttta- cggatgtcaacgt-3 。1.3 pma诱导thp-1细胞的分化及釆用定量pcr检测klhl32基因的表达水平变 化thp-1细胞用含10%胎牛血清的rpmi-1640于37 °c、5% co2条件下在3.5 cm培养皿小培养。pma诱导thp-1分化为巨噬细胞参考已发表文献，取3x105 thp-1单核细胞接种于3.5cm细胞培养皿中，加入pma至终浓度为10ng/ml, 混匀后置37°c培养48h,吸弃培养基，采用pbs缓冲液洗两次，再加入无血清 的rpmi-1640培养基于37°

17、;c继续培养4h。然后吸弃无血清的rpmi-1640培养 基，加入含10%小牛血清的rpmi-1640培养基，同时加入tlr5激活剂st-fla 至终浓度为100ng/mlo置37°c继续培养4h后收集细胞，采用trizol试剂提取 细胞总rna,并测定其浓度和纯度。以roche公司的反转录试剂盒将rna反转 录为cdna,再以cdna为模板进行real-time pcr检测，人klhl32基因上游 pcr 引物 5 gcgacatcaccctgattgct 3 ,下游引物 5 catcagctcca ctttccaccat 3； 内参人卩-actin 上游弓i 物为 5 tggca

18、ccacaccttctacaatg3 ,卜'游引物 5 tctcaaacatgatctgggtcatct 3。具体 方法参照invitrogen公司sybr green real-time pcr试剂盒说明书。所有的数据 格式均为平均值士标准课（mean土se）,统计学分析釆用studentt检验。1.4 pcdna3.1-klhl32-flag真核表达质粒的构建以上述反转录的thp-1细胞cdna为模板，采用pcr技术扩增人klhl32 基因的编码序列。pcr上游引物序列为5y1tggtaccgctggaaaatgc cgtctgaac丁（下划线为 kpn i位点），卜'游引

19、物为5 yjctctagagatgg tgccaatcctgtgatg-3z （下划线为xhal位点），扩增片段大小为1884 bp。 采用高保真dna聚合酶kod plus进行pcr扩增，反应条件为94 °c, 30 s； 60 °c, 1 min； 68 °c, 2 min,共35个循环。将经kpnl和xbal双酶切的pcr扩增产 物克隆至采用同样双酶切的真核表达载体pcdna3.1-flag中，重组质粒经限制 性酶切鉴定与dna测序证实，命名为pcdna3.1-klhl32-flag,表达的蛋白 为竣基端含有flag标签的klhl32融合蛋口。1.5 klh

20、l32蛋白btb结构域突变体质粒的构建通过将klhl32蛋门的btb结构域与keapl和mel-26蛋门的btb结构域 采用clustal多序列对位排列软件进行分析，结果显示它们之间具有高度的同源 性，其屮val83/leu85/gly87与已报道的mel-26蛋白和人keap1蛋白btb结 构域屮参与同cul-3蛋白相互结合氨基酸残基高度同源5,9（图1） o为了分析它 们对klhl32与cul-3结合的可能影响，以pcdna3.1-klkhl32-flag质粒为 模板，采用quickchange点突变试剂盒（stratagene）将它们同吋突变为a。突变 引物 1 序列分别为：5=gtgg

21、agctgatgaggctaatgcgcacgctgtgac cagccttg-3 引物 2 序列为：5'caaggctggtcacagcgtgcgcatta gcctcatcagctccac-3ro具体的操作依据其说明书进行，获得的阳性克隆 经dna序列分析验证后备用，命名为pcdna3.1-klhl32m-flago1.6脂质休介导的瞬时转染和表达hek293细胞用含有10% fbs的dmem,置于5%的co2孵箱屮，37 °c培 养。转染前24h内传代并将细胞接种于6 cm细胞培养皿屮，待其长至约70%融 合时，根据 invitrogen 公罚 lipofectamin

22、e ltx and plus reagents 试剂盒说 明书操作，转染1 ng重组质粒pcdna3.1-klhl32-flag和 空载休质粒 pcdna3.1flag （对照）。转染后细胞置于5%的co2孵箱屮，37 c继续培养24 h。1. 7免疫共沉淀与 western blotting检测转染24 h后收集细胞，采用300|11细胞裂解缓冲液（50mmtrishclph8.0, 0.2% triton x-100 ,150mm nacl, 5% glycerol, 2mm egta, imm dtt, lx蛋白酶 抑制剂）裂解细胞（冰浴lh）,然后t 12000rpm4°c离

23、心lornin，收集上清。 取30川的细胞裂解上清加入10pl的4xsds-page上样缓冲液，95°c 5min,为 细胞全裂解液，200c保存备用。在剩余的裂解上清屮各加入2卩1的抗flag单 克隆抗体，置旋转混匀仪上4°c孵育4h,然后再加入201 protein a/g琼脂糖凝klhl32lnqqrsdgilcditliaeeqkfhahkavlaacsdyframfslcmvesg-adevml 54mel-26yqrlfsqellcdfainvngkiirahkavlaarspvfnamlthqdtdeakssmmyi 55 ir t if t a * keap

24、legihpkvmerliefaytasismgek-cvlhvmngavmyqidswracsdflv110klhl32hgvtslglkqalefaytgqillepg-viqdvlaagshlqllellnlcshyli105mel-26ndmdydviyemvyyiycgrcnkditdmatalliaadkyrleelkshcekylv107 figure 1 alignment of btb domains from human klhl32、keapl and mel-26.图1.人klhl32、keapl与mel26蛋口 btb结构域对位排列结果胶，4°c孵育过夜，再

25、采用裂解缓冲液洗琼脂糖凝胶4次，最后一次离心后吸弃 上清，于每管中加入40卩1的2xsds-page上样缓冲液，95°c 5min,为免疫共沉 淀样品。分别将全细胞裂解液与免疫共沉淀样品采用12%的sds-page蛋白凝 胶电泳进行分离，电泳结朿后将蛋白电转移至nc膜。经5%脱脂奶粉tbst溶 液室温封闭1 h后，再与1 ： 2000稀释的一抗4£孵育过夜，然后与1:2 000稀 释的hrp偶联的抗鼠igg室温孵育1 h后，采用pierce公词的supersignal west pico化学发光底物进行显色，利用kodak is2000r图像工作站进行化学发光检 测。2实验

26、结果2.1 klhl32蛋白的鉴定在前期对美国ncbi高通量基因表达数据库进行分析时，我们发现采用 tlr5受体的特异性配体鞭毛蛋白（flagellin）刺激cd11c+的小鼠小肠粘膜固有 层（laminapropria）细胞4h可诱导klhl家族蛋白中的klhl32表达水平的下 调（数据库编号：gds2212）,提示其可能与细胞的炎症反应调控有关，而对其 的功能研究尚未有报道。通过对ncbi数据库的进一步分析，发现人klhl32 基因组dna定位丁染色体的6ql6.1区，全长216kb,编码蛋白含有620个氨基 酸残基，含冇一个btb结构域与5个重复的kelch结构域，在这两个结构域之 间还

27、存在一个back结构域（图2）。该基因在进化中高度保守，如爪蟾klhl32 基因编码的蛋口与人klhl32蛋口的保守性高达95%,提示其在生物体内可能 具冇非常重要的功能。采用定量pcr对klhl32基因在小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉与皮 肤等8种组织中的表达水平的分析结果显示：klhl32 mrna在脑里面的表达水 平最高，其次为心与肾组织中，而在肝和脾里的表达水平为最低，当以肺内的 klhl32表达水平为基准时（设为1），则其在另外7种组织中的和对表达水平 依次为：29.94±2.21、12.88±1.53、0.21±0.05、0.09±0.04

28、、12.52±125、0.78±026 与 0.43±0.14 （图 3） o154742139 144245290klech klech klech klech klechfigure 2. schematic diagram of btb protein klhl21.btbback图2. klhl32蛋门结构示意图b*3n heart h<er spleen lung kidney muscle skinfigure 3. relative expression of klhl32 mrna in different tissues of mouse

29、图3.小鼠不同组织屮klhl32 mrna相对表达水平三 mc/vzeu zflphnou.2参 zdxooa-aqx2.2 st-fla激活tlr5受体诱导klhl32基因的农达下调为了验证ncbi高通量基因表达数据库的结杲，采用（100ng/ml） st-fla（tlr5特异性的激活剂）刺激pma诱导分化的thp-1巨噬细胞（含有较高的 tlr5受体的表达），4h后收集细胞并应用实时定量pcr技术分析klhl32 mrna表达水平的变化，以il-8基因作为为阳性诱导对照。结果显示:100ng/ml st-fla刺激thp-1巨噬细胞4h可诱导klhl32 mrna水平显著下调（0.586&

30、#177;0.07）（严0.01）,而作为阳性对照的il-8表达水平上调，为未诱导吋 的7.029±1.89倍（/x0.01）,提示klhl32可能参与了 tlr5激活下游的信号转 导通路（图4）。ug/vnmeouossaldx 疳oqri i controliist-fla*klhl32il-8figure 4. the expression of klhl32 was downregulated in thp-1 macrophage cells uponst-fla treatment. n=3 *p<0.05 v5 control.图4. st-fla诱导klhl32

31、基因在thp-1细胞中的表达水平下调2.3 klhl32蛋白对nfkb报告基因表达的影响tlr5受体主要表达于单核细胞，在巨噬细胞屮低表达，其特异性配体是细205菌的鞭毛蛋口。其被激活后可通过接头蛋口 myd88的介导，激活下游的nf-kb转录因子与mapk蛋白激酶，继而促进促炎细胞因子(pro-inflammatory cytokine) 如tnfot、il-1与i型干扰素等的表达，构成宿主对抗细菌感染的第一道防线io。 为了分析klhl32蛋白在细胞炎症反应中的可能作用，将klhl32基因表达载 体pcdna3klhl32flag与含有nf-kb转录因子结合位点的报告基因表达载210 体p

32、nf-ta共转染hek293细胞，以rl-sv40载体作为转染的内参照，转染24h 后采用20ng/ml tnfa刺激细胞，不同时间点回收细胞，采用双荧光素酶报告基 因检测试剂盒检测受nf-kb调控的荧光索酶报告基因的表达活性。结果显示：klhl32蛋白对tnfa诱导的nfkb转染因子活性没有明显影响(图5)。250 200 .150100 -50-_pcdna3.1|kl11l32-fl?g0000.0.0control215figure 5.overexpresion of klhl32 in hek293 cells doesn't interfere the activatio

33、n of nf-kbupon tnfa treatment.图5.过表达klhl32对tnfa诱导的nk-kb的活性无明显影响2.4 klhl32与cul-3蛋白在hek293细胞屮存在相互结合为了分析klhl32蛋白与cul-3蛋白在细胞中是否存在和互作用，以及其220 btb结构域在其中的作用，将真核表达载体pcdna3.1-klhl32-flag与 pcdna3.1-klhl32m-flag采用脂质体分别转染hek293细胞，24小吋后收集 细胞并采用抗flag抗体进行免疫共沉淀实验，通过western印迹实验分析 klhl32蛋口与cul3蛋白z间的相互作用。结杲显示：在hek293细

34、胞中， klhl32蛋白与cul-3蛋白之间存在特异性的结合，而保守的氨基酸残基225 val83/leu85/gly87对其与cul-3的结合至关重要(图6)。3.讨论本研究通过ncbi高通量基因表达数据库的分析，发现特异性激活cd11c+ 的小鼠小肠粘膜固有层(lamina propria)细胞屮的tlr5受体4h可诱导klhlpednaj klhl32 klhl32m pcdna3 klhl32 klhl32mib: anti-cul3ib: anti-flagfigure 6.klhl32 interacts with cul-3 protein through its btb dom

35、ain. 图6. klhl32通过其btb结构域与cul-3相互结合家族蛋口中的klhl32表达水平的下调，采用荧光实时定量pcr技术证实采用 tlr5特异性配体st-fla特异性激活经pma诱导分化的thp-1巨噬细胞同样 可以诱导klhl32表达水平的下调，提示其可能参与了 tlr5受体下游信号通路 的调控。泛素化修饰是蛋口质的一种重要的翻译后修饰形式，它在细胞中不仅可以促 使靶蛋白分子通过泛素蛋白酶体途径被降解，也可以参与调控靶蛋白质分子在细 胞屮的定位与功能，而近年来的研究表明，蛋白质的泛素化修饰在tlr受体被 激活后的卜游信号转导通路中起着不可或缺的作用11。虽然klhl32蛋口在细

36、 胞中可通过其btb结构域与cul-3蛋白和互结合，提示其是一个潜在的e3连接 酶,但进一步的研究却表明klhl32蛋白对tnfa激活的nfkb转录因子活性 没有明显影响。这有可能是因为tnfa受体激活的tnfr1受体下与tlr5受体 被激活后的下游信号通路不同所致，也可能是因为报告基因检测所采用的是 hek293细胞，而非tlr5表达的单核细胞如pma诱导分化的thp-1细胞。对 klhl32在细胞屮功能的进一步研究有赖于鉴定其特异性的靶蛋白分子，并分析 klhl32蛋白促进其泛素化修饰对其功能的影响。参考文献(references)1j malynn 1 ba, ma a, ubiquit

37、in makes its mark on immune regulation. immunity, 2010, 33(6):843-52.21 grabbec, husnjakk, dikic i. the spatial and temporal organization of ubiquitin networks nat rev mol cell biol. 2011; 12(5):295-3073 3) xu l, wei y, reboul j, vaglio p, shin til vidal m, elledge sj? harper jw. btb proteins are substrate-specific adaptors in an scf-like modular ubiquitin ligase containing cul-3 nature 2003; 425, 316-3214 furukawa m, he yj, borchers c, xiong y. targeting of protein ubiquitination by btb-cullin3-rocl ubiquitin ligases. nat. cell. biol. 2003; 5, 1001-10075 5)pintard l, willis jh,