不同品种茯砖茶中优势微生物的分离鉴定

1、不同品种茯砖茶中优势微生物的分离鉴定胡治远i,赵运林2*,刘石泉彳，彭晓 2,李燕子2,龙立平2(1.湖南农业大学食品科技学院，湖南省，长沙市，410128； 2.湖南城市学院化学与环境工程学院，湖南省, 益阳市，413000； 3.湖南农业大学生物科学与技术学院，湖南长沙，410128)摘 要：从湖南地区釆集的18个不同品种茯砖茶样品，采用稀释平板法分离得到18株优势菌， 观察其平板形态特征与生长特征，以及在电镜下有性与无性生殖结构等特点，初步确定其中15 株优势菌为散囊菌属：8株冠突散囊菌(eurotium cristatum )、3株谢瓦散囊菌(eurotium chevalieri)&

2、#187; 2株肋状散囊菌costiforme )» 1株阿姆斯特丹散囊菌(enroliiun amstelodami)和1株 蜡叶散曩菌(eurotium herbariorum );还有3株非散囊®属优势菌为黑曲霉(aspergillus niger )。 实验结果表明茯砖茶中优势微生物存在较大差异。关键词：茯砖茶；优势微生物；平板形态；电镜特征；鉴定分类isolation and identification of dominant microorganisms from different kinds of hunanfuzhuan teahu zhi-yuan1,

3、 zhao yun-lin2 *, liu shi-quan2, peng xiao-yun2, long li-ping2(1. college of chemistry and environment engineering, hunan city university, hunan yiyang, 41300(), china;2. college of food science and technology, hunan agricultural university, changsha 410128, china;3.college ofbioscicncc and biotechn

4、ology changsha 410128» china)abstract： using the flat diluted sample separation method, 18 dominant microbe were separated from the 18 different kinds of hunan brick tea based on the morphological and growth characteristics in flat culture medium, sexual and asexual reproductive structure featu

5、res in electron microscope, the separated 15 dominant strains were identified as eurotium (8 eurotium cristatum strains, 3 eurotium chevalieri strains, 2 eurotium costiforme strains, 1 eurotium amstelodami strain, 1 eurotium herbariorum strain), other isolatcd3 dominant strains were ascertained to b

6、e aspergillus niger. results showed that there was obvious difference in dominant microbe were separated from hunan brick teakey words： brick tea; dominant microbe; hat shape; electron microscope features; identification classificalion.1引言茯砖茶约在1860年前后问世，伏茶早期称“湖茶”；乂因其功效类似于土茯苓，“伙 茶” z名便来源于此，又因原料送到径阳筑制

7、，故还被称为“径阳砖”。茯砖茶主销中国西 北边疆少数民族地区，耐贮藏，便于长途运输。数百年来，茯砖茶以其独特的、不可替代的 作用和功效，与奶、肉并列，成为西北各族人民的住活必需品叫微生物在伏砖茶的品质形 成中，起着不可代替的作用，历来学者对茯砖茶中微生物的种名、生长特性及生物学特征 均进行过一定的研究35,但对于不同品种茯砖茶屮占主导作用微生物的研究并不够全面， 各种优势微牛物与茶叶品质的关系研究也少见于报道。目前我国茯砖茶产业诡缺乏规范，不 少劣质产品充斥着市场，消费者缺乏对产品发花实质的认识，部分消费者其至谋将发霉的砖 茶当做“发花”良好，尤其是近期研究发现不同品种茯砖茶屮“金花”颜色，颗

8、粒人小存在 着一定的差异山|。因此，对不同品种茯砖茶屮微牛物进行系统性的研究，促进黑茶市场统 一标准的建立已迫在眉睦。本研究选取湖南地区较具代表性的茯砖茶作为样品，分离纯化其 中优势菌，基于微生物经典鉴定法12对它们进行分类鉴定，以期为研究微生物与茶叶品质 形成的规律提供理论基础。2 材料与方法2.1实验材料2.1.1茯砖样木来源从湖南黑茶市场购得较貝代表性的茯砖茶18种（來自11个茯砖茶牛产厂家），于阴凉 避光处保存（表1）。表1供试用茶样及來源table 1 the tea samples and their sources样品编号样品名称样品生产厂家样品规格a1湘益五十周年纪念茯茶湖南益

9、阳茶厂有限公司1000ga2湘益牌荷香茯砖湖南益阳茶厂有限公司800ga3金湘益茯砖湖南益阳茶厂有限公司450gb1临湘茶厂茯砖茶湖南临湘茶厂500gc1久扬黑茶湖南久扬茶叶有限公司400gc2处茯速饮金花散茶湖南久扬茶业冇限公司50gd1口沙溪茯茶湖南口沙溪茶厂338gd2白沙溪礼品茯砖湖南白沙溪茶厂20（x）gd3安化茯砖湖南白沙溪茶厂300gd4白沙溪天茯湖南白沙溪茶厂400gei永泰福手工茯砖湖南永泰福砖茶厂35（）ge21979年产永泰福老佚茶湖南永泰福砖茶厂200gf1利源隆茯砖湖南利源降茶厂600ggi黑茶园生活茯砖湖南省安化茶厂700gh1品醇香茶湖南益阳黑茶研究所280g11

10、晋丰厚金花千两茶湖南省安化晋丰厚茶行420gj1永巨贡砖湖南永巨茶叶有限公司400gki湘叶牌特制茯砖茶益阳华茗茶厂5（k）g2.1.2培养基基础培养基：根据对文献的杳阅可知茯砖茶内部环境适合霉菌生长，选择pda培养基, 察氏培养基作为优势菌分离用培养基。鉴定培养基，参考raper冋专著以及samson"等有关文献进行培养基选择：察氏培 养基，20%蔗糖察氏培养基（含蔗糊20%,在文屮简称为c20）。2.2实验方法2.2.1茶叶样品的稀释平板培养将各个茶叶样品川粉碎机粉碎，称取粉碎后的样品25g,放直在含225ml无菌牛理水与 玻璃珠的500ml三角瓶内，盖上封口膜，在振荡仪上200

11、r/min振摇30min,使具屮微牛物充 分分散，制成10"倍样品稀释液。在超净工作台上依次梯度稀释至10',取lml10-3-10-6稀 释度的稀释液涂布于察氏平板上并用涂布器涂布均匀，每个稀释度各设置五个重复，放迸在 恒温箱内28°c倒置培养。从培养的第三天起观察平板上的菌落，并用微生物计数法计算其 在茶叶中的含量切（cfu/g干样），将数量最多的微生物确认为该茶样中的优势微生物。 2.2.2优势菌的分离纯化与保存选择生长状况合适的平板，用接种针挑取优势菌菌落，于察氏培养基上进行划线分离, 这样反复34次后获得纯培养的菌株，转接斜面管，将其编号后置4°

12、c冰箱内保存。2.2.3优势菌的形态学观察取4°c保存的金花菌株在常温下复苏24h后，转接于察氏平板与c20平板上，置于恒温 培养箱内28°c静置培养，每天观察菌落的生长情况并作好记录。2.2.6优势菌的扫描电镜观察挑取察氏平板上生长到适宜大小的菌落制成标本并固定，常规法制片后，在扫描电子显 微镜（由li立电了株式会社生产，型号jsm-6380lv）下观察其菌丝、闭囊壳、了囊、了囊 抱子、分主抱子头等的形态并拍照。3 结果与分析依据各个菌株在平板上的形态特征（图1）,电镜卜分生他子头（图2）、分生他子以及 了囊抱了（图3）、闭囊壳等结构特征的不同将2（）株优势微生物分为6类

13、（优势菌的编号均 采用來源茶叶样品的小写编号代替）：cl、c3、jl为近似菌株，在察氏平板上生长速度非常快，7d时菌落直径为557（）mm, 质地丝绒状，菌落正面为黑褐色，反面呈黄色，产生人聚分生砲了。其电镜下特征为：无闭 囊壳结构，分生抱子头为球形，直径250400um,分牛砲子梗发牛于基质，外壁光滑；分工 他子球形，直径35um,壁粗糙，具不规则的纵向条纹。al、a2> a3、c2> d3 el、flgl为近似菌株，7d时菌落肓径在2228mm之间，人部 分为圆形或椭圆形，也有不规则的存在，菌落中央厚度略简于边缘，结构较致密，边缘呈橄 榄黄色，往中央颜色逐渐加深，中央部分颜色为

14、橄榄褐色，生长时间佼长的部位有少许黑褐 色香汕状渗出液，菌落周i韦i的培养基亦被色素染成茶褐色，以闭囊壳为主，菌落边缘可见少 量灰绿色分生抱了头。菌落反而为深黄至棕色。其电镜下特征为：闭囊売为球形或近球形, 肓径1（）018（）um； 了囊为球形，1（）14um； 了囊抱了呈双凸镜形，有两个明显的纵向鸡冠状 突起，抱了体人小为56umx45um,凸面比较粗糙，具尖疣；分生抱了头呈疏松放射形， 抱子梗牛:自基质，总径为59um,壁光滑；顶囊近球形或烧瓶形，直径1225um；瓶梗 6.510umx2.53.4um,着生于顶囊上半部；分生他子为椭圆形，45umx34um,他子壁粗 糙，具小刺。a4、

15、订为近似菌株，其菌落生长速度较快，7d时直径达3542mm，颜色为米黄色，随 培养时间增长颜色略有加深，人量浅黄色菌丝呈辐射状由屮央向四周分布，分牛殖子头为灰 绿色，在分布上以菌落周围多于中央，在菌丝中可观察到大量蜡黄色闭囊壳，棊木不产生渗 出液，菌落反面为黄色。具电镜卜特征为：闭囊売为球形或近球形，直径100-140um；子囊 为球形或近球形，直径1417um；子囊沦子呈双凸镜形，5.56.5umx4.85.5um,有两个明 显的“赤道”冠，宽约0.6um,凸面冇不规则网结的肋状突起；分生他了头生于菌丝，他梗 茎直径为812um,壁光滑，顶囊球形或近球形，直径20-30um；分生抱子为椭圆形

16、，大小 3.55umx34.5um, 子壁具小刺。bl菌落生长速度较快，7d时直径为3640mm,菌落厚度较薄，具不规则皱纹；闭囊壳 呈亮黄色，分布以屮央为主，分主抱子较多，暗灰绿色，有少量渗出液，菌落反面为黄色, 亦可见不规则皱纹。其电镜下特征为：闭囊壳为近球形，直径80160um；子囊他子呈双凸 镜形，4.65.5umx3.54um,他了两瓣中间具沟，冇不规则的脊，凸面粗糙；分生抱了头呈 疏松短柱形，110180um；分牛抱子梗直径8llum,壁光滑；顶囊为烧瓶形；分主抱子为 园球形，45um,砲子壁具小刺。b2、d2、kl为近似菌株，在20%蔗糖察氏平板上7d时菌落直径为2530mm，总

17、体厚 度一致，具不明显的辐射状沟纹；菌落屮心颜色为深黄色，往周围颜色逐渐变淡，菌落反面 深黄至棕色。其电镜下特征为：闭囊売为球形，直径120160um,子囊近球形，710um； 子囊抱子呈双凸镜形，4x5um3x4um, “赤道”部分具鸡冠状突起，凸面有小的突起；分 生抱子头球形至辐射形，145240um；抱子梗主于基质或气生菌丝，抱梗茎直径为7.014um, 壁光滑；顶囊为烧瓶形，他梗茎顶端稍膨大；分生紀子为球形，45umx2.53.5um,他子 壁具小刺。c4在20%裁糖察氏平板上住长速度较慢，7d时直径为1823mm,颜色为灰绿色至黄褐 色，菌落周围产生较多的灰绿色分生他子，中央以闭囊壳

18、为主，菌落反而为近红褐色。其电 镜下特征为：闭囊壳为近球形，100180um； 了囊为球形，1216um； 了囊他了呈双凸镜形, 6.57.5mx45.5um,赤道部位具明显但较浅的沟，两侧有较低的脊，凸面光滑；分生抱子 头呈扫帚形，沦梗直径8-16um,外表光滑；顶囊椭圆形，254&im；分生他子为椭圆形， 56umx 79um,他了壁具小刺。表2不同茶叶样品中优势微生物的种类及含量(cfu/g t样)tabic 2 different tea samples of advantage of microbial kind and content (efu/g dry kind)茶样編

19、号优势菌种类含盘茶样編号优势菌种类含重al冠突散囊菌2.8 x106d4蜡叶散囊菌2.0 x105a2冠突散獲菌9.3x10ei谢瓦散诞菌7.0x10a3冠究散瘻菌1.9xi06e2冠究散嶷菌8.0 x104bl肋状散蛭菌3.8x104f1冠突散囊菌4x105cl阿姆斯特丹散囊菌1.2x105g1冠突散癱菌5.6x104c2谢瓦散囊繭1.0x106iii冠突散囊菌6.2 x105dl黑曲毎2.() x 10 sii肋状散遨菌5.0x104d2冠突散囊菌2.8x101ji黑曲霉4.8 x104d3黑曲霉1.75x10ki谢瓦散诞菌7.2 x105图1部分优势菌(散囊菌属)在c20培养基平板上生长

20、7d时的照片lal； 2a2； 3.a3； 4.bl； 5.cl； 6.c2； 7d2； &d4；9.el； 10.e2； ll.fl； 12gl； 13.hl； 14.il； 15.klfigure i part advantage bacterium (of) in scattered capsule bacteriac20 medium plate to grow on 7 d of photographlal； 2,a2； 3.a3； 4.bl； 5.cl； 6.c2； 7d2； &d4；9.el； 10.e2； ll.fl； 12gl； 13.hl； 14.il； 1

21、5.kl图2部分优势菌（散囊菌属）电镜下分生砲子头照片l.al； 2.a2； 3.a3； 4.bl； 5.cl； 6.c2； 7.d2： 8.d4；9.el； 10.e2； ll.fl； 12gl； 13,hl； 14.il； 15.klfigure 2 parts scattered advantage bacterium (sac) by electronmicroscopy of bacteria conidium head photosl.al: 2.a2； 3.a3； 4.bl； 5.cl： 6.c2； 7.d2： &d4；9.el； 10.e2； ll.fl； 12gl；

22、13.hl； 14.il； 15.kl342107896a14图3部分优势菌(散疵菌属)电镜下子囊抱子照片l.al: 2.a2； 3.a3； 4.bl； 5.cl； 6.c2； 7,d2： &d4；9.el； 10.e2； ll.fl； 12gl； 13.hl； 14.il； 15.kl figure 3 parts scattered advantage bacterium (sac) by electron microscopy of bacteria ascospore one photol.al ； 2.a2； 3.a3； 4.bl ； 5.cl ； 6.c2； 7d2： 8.

23、d4；9.cl； 10.e2； ll.fl； 12gl； 13.hl； 14.il； 15.kl依据微生物的经典鉴定法,2'13,得到以上20个菌株的鉴定结果：dl、d3、j 1 为:黑曲霉 aspergillus niger；al、a2> a3、d2、e2、flgl> hl 为:冠突散囊菌eurotium cristatum,无性型名称:小 冠曲霉,aspergillus cristatellus；bl >il 为：肋状散囊菌 eurotium costiforme,无性型名称:肋状曲霉 aspergillus cos t ifo rm is； cl为：阿姆斯特丹散

24、囊菌eurotium amstelodami,无性型名称：葡萄aspergillus vitis； c2 el kl为：谢瓦散囊菌eurotium chevalieri,无性型名称：谢瓦曲aspergillus cheualieri ；d4为：蜡叶散囊菌eurotium herbariorum,无性型名称：灰绿曲得aspergillus glaucus。4 讨论实验结果表明18个湖南茯砖茶样品屮的优势微生物包括3株黑曲霉、8株冠突散囊菌、 3株谢瓦散囊菌、2株肋状散囊菌、1株阿姆斯特丹散囊菌和1株蜡叶散囊菌。其中有15个 为散囊菌属(link),这说明散囊菌在不同的茯砖茶中普遍存在一冃.占主导

25、地位。除 了已被之前研究者们证明了的茯砖茶发花微生物冠突散囊菌，其他散囊菌如谢乩散囊菌、阿 姆斯特丹散囊菌和肋状散囊菌在茶叶中也有较髙的含量甚至占据主导地位，而11大多数培养 特征为金黄色或近黄色，据此可认为，茯砖茶内的“金花”，除了山冠突散囊菌繁殖产牛外, 还有一部分是由其他散囊菌产生的。尤其值得注意的，茶样e2为永泰福茶厂1979年生产 的老茯砖，经过三十多年的放置后，仍然从中成功分离出了冠突散囊菌(菌株c2,在茶叶 中含量为8.0x104cfu/g),这说明冠突散囊菌的抱子在t燥和儿乎无营养的条件下，可以进 行长达数十年的休眠，这与温琼英等对冠突散囊菌沦子耐受能力的描述相一致i阖。茶样h

26、l为湖南益阳黑茶研究所牛产的一品醇香茶，研究所采取与传统技术路线不同的 调控发花手段，所接种的原始菌株由茶样a3 (金湘益茯砖茶)屮分离获得，经过多次继代 培养后，两种茯砖茶在“金花”颗粒大小、色泽，以及茶叶菌花香气等方面存在着一定的差 界，曾被怀疑优势菌是否还是原来的金花菌，根据平板培养与电镜观察的结果，两个菌株在 形态特征上基本一致，说明该菌株作为生产用菌种具备遗传上的稳定性。茶样di、d3、j1中的优势微生物均为黑曲霉，这在成品茯砖茶中应属于不正常的现彖, 黑1111霉在茯砖茶的渥堆时期曾经人量存在并对茶叶品质有着初步改善作川3】，但经过气蒸 和压制进入发花阶段后，喜湿的黑illi霉理应

27、“让位”给耐干燥的散囊菌属，正常的茯砖茶成 品内黑曲霉含量应在103cfu/g以下。使黑曲霉在茯砖茶内占优势地位的主要原因是由于对烘 房坏境调控欠住，湿度过高导致黑illi霉人量牛长。黑illi霉牛长较多的茶叶霉味较重且香气不 足，严重影响了产品品质。由表2 nj知，不同的茯砖茶中优势菌含量差别较大，从授高的2.8x106cfu/g到最低的 7.0x 103cfu/g,这说明市场上的茯砖茶发花质量不够稳定，即便是同一家茯砖茶企业牛产的 产品，其小微生物的种群含量也可能相差较大(如发花的样品d1与未发花的样品d2皆为 湖南白沙溪茶厂的产品)。因此，对传统的茯茶生产工艺进行改良，捉高产品发花质量是

28、保 证茯茶市场活力的重要方面。茶叶屮检出的非优势微牛物主耍还包描产紫青霉、橘灰青霉、 毛硯等，有6样品份检出产紫青瀛9份检出橘灰青龜4份检出毛箒 由此说明湖南地区 茯砖茶中微生物具备多样性，各种优势非优势微生物对茯砖茶品质形成的影响和它们相互之 间的作用还需要进一步研究。参考文献：1 王融初，彭雄根.茯茶生产科技发展与西北民族情缘j,茶叶通讯,2007,34(1) : 44-47.2 刘勤晋，司辉清.黑茶营养保健作用的研究j,中国茶叶，1994,(6) ： 36-37.陈晓阳茯砖茶的生产与传播j,茶叶通讯，1997(1) : 41-42.14杨抚林，邓放明.茯砖茶发花过程小优势菌的研究进展j,茶叶科学技术,2005 (1)： 4-7.5 胡建程,胡月