大肠菌群检测

1、曹双：请综合看看各种方法，比较一下，有些内容是一致的，有些是 每种方法不同于其他方法的，注意比较。第一篇（蓝色部分为说明和附录，去掉这部分剩下的为连续文件）大肠杆菌检验方法SN 0169 92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方 法GB/T 4789.6 1994 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 （这两个检验方法另有完全的 PDF文件，见文件夹）以SN标准方法为例，进行说明。样品制备：以无菌操作取25 g样品，放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质12min,制成1:10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。稀释样品匀液根据对样品污染情况的

2、估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列 十倍递增的样品稀释液，如10*-2、10*-3、10*- 4。从制备样品匀液至稀 释完毕，全过程不得超过15min。附：这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法（最近似法）？MPN法简介发布日期：2010-05-13 浏览次数：212The Most Probable Number MethodIn the followi ng example, a set of 3 tubes ofan all purpose broth medium is in ocuThe Most Probable Number MethodIn the follow ing

3、example, a set of 3 tubes of an all purpose brothmediumis inoculated from each of the ten-fold dilutions, with each tube being ino culated with one ml.从一ulb;"OO0 可爪I 1/7Illi- trHQJ ®0© a-JI 一 q -3- "Tvxie少 ®© I JAfter incubation.the number of tubes showing growth is rec

4、orded.Asthe succeed ing diluti ons were made, the orga ni sms were diluted to such an exte nt that none were in the ino cula of seve n of the tubes (marked n egative). I n order to estimate the nu mber of orga ni sms per ml of thesample which would cause this kind of growth response, we locate the t

5、hree sets of tubes which showdiluti on of the orga ni sms "to ext in cti on" i.e., those tubes which were inoculated from the 10- 2, 10 - 3 and 10 - 4 diluti ons.附录1g检样中最近似值（MPN表（补充件）以 0.1、0.01、0.001g 各用 3 管阳性管数丨1 MPN阳性管数 I1 MPN0.1 0.01 0.001| 0.1 0.01 0.001I 9.1| 14| 202601013|210| 150111

6、 6.1 |211| 2001219.2 |212| 27013I12 |213| 34020I 6.2 |220| 21021I 9.3 |221| 28022| 12 |222| 35023| 16 |223| 42030|9.4 |230| 29031|13|231| 36032| 16 |232| 440331|19|12331| 5310101|3.6 |3010| 23101|7.2 |301| 39102| 11 |302| 64103|15|303| 95110|7.3 |310| 43111| 11 |311| 75112|15|312| 120113|19|313| 160

7、120| 11 |320| 93121丨15|321 |1501221 20 |322 |210123124|323|290130I 16|330 |240131I 20|331 |460132I 24|332 |1100133I 29|333|> 1100LST和EC初步筛选：对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三 管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤，每管接种1mL。将接种管置于36±C 培养48±2h o观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生 ，用直径为3mm的接 种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移

8、种于EC肉汤管中。将所有接 种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5 ±0.5 C水浴箱内,培养48±2h。附：LST肉汤、EC肉汤有些什么？LST肉汤和EC肉汤中有什么？(发酵乳糖产气)月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤EC肉汤胰蛋白(月示)或胰酪胨 仃rypticase) 20g胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g氯化钠5.0g3号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)2.75g磷酸氢二钾(K2HPO4)4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5g月桂基硫酸氯化钠5.0g钠0.1g蒸馏蒸馏水

9、1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mrW 150mm试管(管内有倒立的小发酵 将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的 20mrW 150mm试管中，每管10mL。121C高压灭菌 15min。最终pH6.8±0.2。管),每管8mL。121C高压灭菌15min,最终H6.9±0.1。EMB平板：取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36 ±1 C培养24±2 h。检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落 。如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落， 则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接

10、种针接触菌落中心部位，移种到营 养琼脂斜面上,36 ±1 C培养1824h。附：怎样进行平板划线分离？平板划线分离的方法发布日期：2010-09-01浏览次数：2021.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法Cufm 冃伯i白 MeUnodiScml-quancllDllva口M«nll 阳餌阳E p Wmpi 阿却旬nPDim-d 钟EM 44平板划线示例平板划线示例发布日期：2010-09-01浏览次数：612平板戈U线示例 This is an example of a good stre平板划线示例This

11、is an example of a good streak for isolati on using the "four corn ers" method.The small colonies here are of Staphylococcus epidermidisThis is not a great streak plate but it is serviceable, as there are a few isolated coloni es. This plate would have been better if the loop had been flam

12、ed betwee n each sector.This is an example of how NOTto streak for isolati on. Scribbli ng is not streak ing, and most likely will not result in isolated coloniesThis plate isolates two differe nt coloni es: Escherichia coli (the cream-colored)coloni es,and Serratiamarcesce ns (the red colo nies).(

13、粘质 沙雷菌)This is a plate with Micrococcus luteus 滕黄微球菌，the yellow colonies. While this is a good streak for isolati on, the plate has bee n con tam in ated. The large "fuzzy" colonies are fun gal coloni es.The lid may have been lifted too far away from the plate while streaking,or a draftmay

14、 have caused the spores to fall into the plate.EMB平板原理及照片EM呼板照片及原理发布日期：2010-05-13浏览次数：238This image illustrates the growth of gram-negative bacteria that cannot ferment lactose on eosin methylene blue (This image illustrates the growth of gram-n egative bacteria that cannot ferment lactose on eosin

15、methylene blue (EMB) agar. EMB agar contains bile salts and dyes which in hibit growth of gram-positive bacteria. Growth on EMB agar is a useful diagnostictool to distinguish between lactose fermenters and nonfermenterswhich will appear colorless. This image can be used to describe the use of metabo

16、lism in ide ntificati on of bacteria.Salm on ella and Shigella, both nonl actose ferme ntingpathoge ns, can be dist in guished from the more com monin testi nalflora which ferme ntlactose.Infemb-an.jpg Lactose Nonfermenter on EMBPat Johnson, Palm Beach Community College, Lake Worth, Fla., USA生化试验：将斜

17、面培养物移种到下列培1 色氨酸肉汤：在36±C培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.20.3mL, 上层出现红色为靛基质阳性反应。附：靛基质试验原理及照片靛基质（Indole ）试验：靛基质试验原理及照片发布日期：2010-05-13浏览次数：290某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现岀来。吲哚与对二甲基氨基靛基质（In dole ）试验：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36 ± 1

18、C培养24h时后，取约2ml培养液，加入 Kovacs氏试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二 甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入 Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。fl啊Hi作 IraainleWiLh 吧 ladfllej ASM MErobuUbiiry.ang & JohnsonMargaret (Peg) Joh nson. Mesa Co

19、mmu nity College, Mesa, Ariz., USAThis image depicts the results of n egative and positive in dole tests. The in dole test is freque ntly employed to disti nguish Klebsiella or En terobacter bacteria(indolenegative) from Escherichia coli (indolepositive). The presenee of E. coliis used by public hea

20、lth officials as an indicator of fecal contamination of food and water supplies.Prior to this test, En terobacter aeroge nes was used to ino culate one trypt one broth, while ano ther trypto ne broth was in oculated with Escherichia coli. The two broths were the n in cubated for 24 h and mixed with

21、Kovas reage nt (p-dimethylami no-be nzaldehyde).Trypt one broth is rich in the ami no acid tryptopha n.Tryptopha nase, an en zyme, is capable of cleavi ng tryptopha n and produci ng in dole, pyruvic acid, and ammonia. In dole can be detected by the developme nt of a red color after addi ng Kovas rea

22、ge nt. Orga ni sms that do not produce tryptopha nase will be in dole n egative, as no in dole will be prese nt to react with the Kovas reage nt2 MR-VP培养基：在36±C培养48±2h。以无菌操作移取培养物 1 mL 至13m材100mm试管中，加5% a萘酚乙醇溶液0.6mL,40 %氢氧化钾溶液0.2 mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h,如出现伊红色，为VP试验阳性。将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基

23、红溶液。如培养物变 红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。附：MR-VP试验原理及照片MR-VP试验原理及照片发布日期：2010-05-13 浏览次数：224甲基红(Methyl Red)试验 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由 于糖代谢的途径甲基红(Methyl Red )试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸， 进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。V-P试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙

24、酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合 物，称V P（ +）反应。大肠杆菌：MR + /VP -3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1°C培养96h记录有无生长。附：枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片枸椽酸盐试验原理及斜面照片发布日期：2010-05-13 浏览次数：136枸椽酸盐试验：某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源， 将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于枸椽酸盐试验：某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳， 培养基反应后成碱性，由于指示

25、剂的作用，培养基变为兰色。说明：SN标准所用培养基是肉汤培养基，且不加指示剂，因此，只能观察是否浑浊生长。Koser氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠(NaNH4HPO44H2O)1.5g磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g硫酸镁(MgSO4 7H2O)0.2g枸椽酸钠(含2H2O)3.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10 mL,12C高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。4 LST肉汤：于36 ±1 C培养48 ±2h,观察试管中是否产气。5革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革 兰氏阴性。大肠杆菌与非大肠杆

26、菌生化鉴别如下：菌+ 1-11+1+11-1-1-1-11 1典型大肠杆菌 非典型大肠杆111 1+ 1+ 1- 1 + 1典型中间型-1+ 1- 1 + 1非典型中间型1 111d1 1 +1 +丨典型产气肠杆菌+ 1 1 +1 +丨非典型产气肠杆菌11 11如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必 要时做 重复试验。结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽抱杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为+ +或 + ，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克（毫升）样品中大肠 杆菌MPN值。第二篇大肠菌群测定的操作细则（MPN法）大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需

27、氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中大肠菌群数系以 100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。1设备和材料1.1 温箱：36 ±1 Co1.2冰箱:04 Co1.3 恒温水浴：44.5 ±.5 Co1.4天平。1.5显微镜。1.6均质器或乳钵。1.7 平皿:直径为90mm。1.8试管。1.9吸管。1.10广口瓶或三角烧瓶：容量为500mL。1.11玻璃珠:直径约5mm。1.12载玻片。1.13酒精灯。1.14试管架。2培养基和试剂2.1乳糖胆盐发酵管：按G

28、B 4789.28中4.9规定。22伊红美蓝琼脂平板：按GB 4789.28中4.25规定。2.3乳糖发酵管：按GB 4789.28中4.10规定。2.4 EC 肉汤:按 GB 4789.28 中 4.11 规定。2.5磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。2.6生理盐水。2.7革兰氏染色液：按GB 4789.28中2.2规定。3操作步骤3.1检样稀释3.1.1以无菌操作将检样 25mL（或g）放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃 瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器，以8 000-10 0

29、00 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。3.1.2用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的 试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。3.1.3另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支 1mL灭菌吸管。3.1.4根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管。3.2乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。 每一稀释度接种3管,置36±1 C温箱内,培养2

30、4±2h, 如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者,则按下列程序进行。3.3分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1 C温箱内，培养18-24h,然后取出,观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。3.4证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1C温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。3.5报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。4 粪大肠

31、菌群（faecal coliform）4.1用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见3.2条）转种于EC肉汤管内，置44.5 ±0.2 C水浴箱内 冰浴箱内的水面应高于EC肉汤液面）,培养24±2h,经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美 蓝琼脂平板上，置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。4.2结果报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）粪大肠菌群 的 MPNS。第三篇出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法Method for e

32、xamination of coliform ， fecal coliform and escherichia coli in food for exportSN 0169 92代替 ZB X09 002 861 主题内容与适用范围 本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。 本标准适用于出口食品的检验。2 设备和材料2.1吸管：1mL，具O.ImL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。2 2 水浴箱：44.5 ±5C。2.3 培养箱：36±C, 44.5 ±.5 C。2.4冰箱：05C和-15-20 C。2.5 均质器。2.6 乳钵和研棒。

33、2.7 平皿：直径 90mm。2.8 天平：感量 0.1g。2.9 显微镜。2.10 稀释瓶： 100mL、200mL 和 500mL 三角烧瓶及广口瓶。2.11 玻璃珠：直径约 5mm。2.12 菌落计数器。3 培养基及试剂3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白 (LST) 肉汤。3.2 煌绿乳糖胆盐 (BGLB) 肉汤。3.3 EC 肉汤。3.4 伊红美蓝琼脂 (EMB) 。3.5 营养琼脂斜面。3.6 色氨酸肉汤。3.7 MR-VP 培养基。3.8 Korser 氏枸椽酸盐肉汤。3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA) 。3.10 Butterfield 氏磷酸盐缓冲稀释液。3.11 生理盐水。3

34、.12 革兰氏染色液。3.13 Kovacs 氏靛基质试剂。3.14 甲基红指示剂。3.15 Voges pros kauer(V P)试剂。4 样品制备4.1 以无菌操作取有代表性的样品。 如有包装则用 75 乙醇在开口处擦拭后取样。 若不能及时检验，应将冷冻样品置于 -15 C保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4 C冰箱保存。检验前冷冻样品可于 2 5 C 18h内解冻，或在 45 C以下15min内解冻。4.2 不同食品样品匀液的制备4.2.1 液体食品以灭菌吸管取样 25mL 放入装有 225mL 稀释剂的灭菌玻璃瓶 (瓶内预置适当数量的玻璃珠 )， 以30cm幅度、于7s内振摇25次（

35、或以机械振荡器振摇），制成1: 10的样品匀液。4.2.2 固体和半固体食品以无菌操作取25g样品，放入装有 225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r/min均质12min，制成1： 10样品匀液（也可用灭菌乳钵研磨的方法代替）。4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计， 用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如 10-2、10-3、10-4.。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。5 大肠菌群的测定5.1 大肠菌群 MPN 值的测定5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白 （LST） 肉汤，每管接种

36、1mL。5.1.2将接种管置于 36±1 C培养48±h。5.1.3观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。如所有 LST 肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一 步作证实试验。5.2 大肠菌群的证实试验5.2.1将所有产气管用直径为 3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐 （BGLB）肉汤管中。5.2.2置BGLB肉汤管于 36±1C培养48±2h。5.2.3 记录所有 BGLB 肉汤管的产气管数。5.2.4结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查 MPN表（见附录B（补充件）报告每克（毫升）

37、样 品中大肠菌群的 MPN 值。6 粪大肠菌群测定6.1用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于 EC肉汤管中。6.2将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5 ±.5C水浴箱内，培养 24±2h。水浴 箱的水平面应高于肉汤培养基液面。 应以已知为44.5 C产气阳性的大肠杆菌和 44.5 C不产气 的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。6.3 记录 EC 肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试 验阴性。6.4 结果报告：按产气管数，查 MPN 表报告每克 （毫升）样品中粪大肠菌群的M

38、PN 值。7 大肠杆菌测定7.1将6.3条中的EC肉汤管继续培养 24h,取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝（EMB）平板，36±1C培养24+2ho7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取 2 个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1C培养 1824h。7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。7.4.1色氨酸肉汤：在 36 ±1 C培养24±2h后，力口 Kovacs氏试剂0.20.3mL,上层出现红

39、色 为靛基质阳性反应。7.4.2 MR VP培养基；在36 ±1 C培养48±2h。以无菌操作移取培养物 1mL至13mnX 100mm 试管中，加5%a萘酚乙醇溶液0.6mL , 40%氢氧化钾溶液 0.2mL和少许肌酸结晶，振摇 试管后静置2h，如出现伊红色，为 VP试验阳性。将MR VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。743 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±C培养96h记录有无生长。744 LST肉汤：于30 ±1 C培养48±2h，观察试管中是否产气。745革兰氏

40、染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：靛基质MRVP枸椽酸盐鉴定（型别）+ +-典型大肠杆菌- +-非典型大肠杆菌+ +-+典型中间型- +-+非典型中间型- -+典型产气肠杆菌+ -+非典型产气肠杆菌如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯, 应重新划线分离, 必要时做重复试验。7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC 试验为 +-或-+- ，再根据 LST 肉汤阳性管数查 MPN 表，报告每克 （毫升）样品中大肠杆菌 MPN 值。8 大肠菌群固体培养基测定法8.1 样品

41、制备同第 4章。8.2 计数8.2.1选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。另取 lmL 稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。8.2.2将冷至45±0.5C的结晶紫中性红胆盐琼脂 （VRBA）1015mL倾注于每个平皿中。小心 旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。8.2.3 待琼脂凝固后，再加 34mLVRBA 覆盖平板表层。8.2.4翻转平板，置于 36±C培养1824h。8.2.5 选用有 30 150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫 红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为 0.5mm 或更大。8.2

42、.6 证实8.2.6.1 从 VRBA 平板上挑取 10 个不同类型的典型和可疑菌落，移种于 BGLB 肉汤管内， 36 ±1 C培养24h和48h，观察产气情况。8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色， 以便排除革兰氏阳性杆菌。8.2.7 结果报告经最后证实为阳性 （产气，革兰氏阴性杆菌 ）的试管百分比乘以于 8.2.5 条中计数的平板菌落 数，再乘以稀释倍数，即为每克（毫升 ）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液ImL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB 肉汤管，证实有 6个阳性管，则该样品的

43、大肠菌群数为：100X6/ 10X104/g（mL） = 6.0 >105/ g（mL）附 录 A培养基和试剂（补充件 ）A1月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤胰蛋白 或胰酪胨 （Trypticase）20g氯化钠5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾 (K2HPO4) 2.75g 磷酸二氢钾 (KH2P04) 2.75g 月桂基硫酸钠 0.1g蒸馏水 1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中。高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。A2 煌绿乳糖胆盐 (BGAB) 肉汤蛋白胨 10.0g乳糖 10.0g牛胆粉 (oxgall 或 oxbile) 溶液200.0mL0. 1 煌绿水溶

44、液13.3mL蒸馏水将蛋白胨乳糖溶于约 500mL 蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL蒸馏水中，pH7.07.5)，用蒸馏水稀释到 975mL ,分装到有倒立发酵管的 20mm150mm试管中，每管10mL°12lC液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到121 C高压灭菌15min。最终立的小发酵管 )中，每管10mL。A3 EC 肉汤胰蛋白 或胰酪20.0g3 号胆盐或混合胆盐1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾(KH2P04)4.0g磷酸二氢钾(KH2P04)1.5g氯化钠5.0g蒸馏水1000.0mL将以上成分溶解于蒸馏水中，200mL( 将 20.0g 脱

45、水牛胆粉溶于pH7.4。再加入20mmm l50mmpH7.2±0.1 。0.1 煌绿水溶试管 (管内有倒分装 16mmm 150mm 试管(管内有倒立的小发酵管)，每管 8mL。121 C 高压灭菌 15min，最终 pH6.9 ±1。1。A4 伊红美蓝琼脂 (EMB)蛋白胨 10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾 (KH2P04)2.0g琼脂15.0g伊红丫水溶性)0.4g或2%水溶液20mL美蓝 0.065g 或 0.5水溶液13mL蒸馏水1000.0mL在 1 000mL 蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL

46、，高压灭菌15min。最终pH7.1 ±0.2。使用前将琼脂融化，于每 100mL琼脂中加5mL灭菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊红丫水溶液和1.3mL0.5 %的美 蓝水溶液，摇匀，冷至4550 C倾注平皿。A5 营养琼脂斜面牛肉膏3.0g蛋白胨5.0g琼脂15.0g蒸馏水 1000.0mL将各成分加于蒸馏水中， 煮沸溶解。分装合适的试管。121 C高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。 灭菌后摆成斜面备用。A6 色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨 10.0g蒸馏水 1000.0mL加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121 C高压灭菌15min。最终

47、 pH6.9±0.2。A7 MR-VP 培养基胨7.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾 (K2HPO4)5.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121 C高压灭菌15min，最终pH6.9±0.2。A8 Koser 氏枸椽酸盐肉汤磷酸氢铵钠 (NaNH4HPO4?4H2O) 1.5g磷酸氢二钾 (K2HPO4)1.0g硫酸镁 (MgSO4?7H2O)0.2g枸椽酸钠 (含 2H2O)3.0g蒸馏水1000.0mL将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL, 121 C高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。A9 结晶紫中性红胆盐琼脂 (VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖 10.0g氯化钠5.0g胆盐或 3 号胆盐1.5g中性0.03g结晶紫0.002g琼脂1518g蒸馏水1000.0mL将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至pH7